Nei†Tuatusi o loʻo iai nei: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
O le vaega autu o le reaction center light-harvesting complex 1 (RC-LH1) o le vaega autu lea o le photosynthesis o siama violē phototrophic. Na matou faʻalauiloaina ni fausaga se lua o le cryo-electron microscopy o le RC-LH1 complex mai le Rhodopseudomonas palustris. O le fausaga 2.65-Å resolution o le RC-LH114-W complex e aofia ai le 14 subunit LH1 loops e siomia ai le RC, lea e motusia e le porotini W, ae o le complex e aunoa ma le porotini-W o le RC composite atoa lea e siomia e le RC. Tapuni le 16 subunit LH1 loop. O le faʻatusatusaga o nei fausaga e maua ai ni malamalamaaga i le gaioiga o le quinone i le RC-LH1 complex, e aofia ai suiga o le conformational e leʻi faʻamautuina muamua pe a fusifusia le quinone i le RC QB site, faʻapea foʻi ma le nofoaga o auxiliary quinone binding sites, lea e fesoasoani e tuʻuina atu i le RC. O le fausaga tulaga ese o le porotini W e taofia ai le tapunia o le LH1 loop, ma faʻapea ona fausia ai se auala mo le faʻavavevaveina o le fesuiaiga o le quinone/quinolone.
O le malosi e maua mai le photosynthesis e mafai ona fa'atumauina toetoe lava o mea ola uma i le lalolagi, ma e tele lona gafatia mo le biotechnology o le la. A'o fa'alauiloaina le photosynthesis i le lalolagi atoa, o siama violē phototrophic e fa'aalia ai fo'i auala eseese o le malosi ma le gafatia o le metabolism. E mafai ona latou 'alofia le photosynthesis ma tuputupu a'e o ni siama heterotrophic i le pogisa, e mafai ona fa'amautu le nitrogen ma le carbon dioxide, gaosia le hydrogen, ma fa'aleagaina mea manogi (1-3). Ina ia maua ai le malosi mo nei faiga, e tatau ona vave ma lelei le liua o le malamalama i le malosi fa'akemikolo. E amata lenei faiga pe a mitiia e le antenna complex e pu'eina le malamalama le malamalama ma fa'aliliu atu le malosi ua pu'eina i le nofoaga autu o tali (RC), ma amata ai le vavae'eseina o le totogi (4 – 7). O le iunite autu o le photosynthesis i siama violē phototrophic e aofia ai le ituaiga 2 RC, e si'omia e le light-harvesting complex 1 (LH1), e fausia ai le RC-LH1 core complex. O le LH1 e fausia e se fa'asologa o αβ heterodimers pi'o, e tofu ma le fusifusia o molela'au chlorophyll (BChl) a bacteria e lua ma le tasi pe lua carotenoids (8-12). O le antenna LH1 faigofie e aofia ai le 16 pe 17 αβ heterodimers o loʻo siʻomia le RC (9-13) i totonu o se matasele tapuni, ae i isi vaega autu, o peptides transmembrane e faʻalavelaveina le faʻaauauina o le LH1 o loʻo siomia ai, ma faʻalauiloa ai le quinol/quinone diffusion i le va o le RC ma le cytochrome bc1 complex (11, 13-15). O le laʻau violē phototrophic Rhodopseudomonas (Rps.) o se meaola faʻataʻitaʻi e mafai ona malamalama i le malosiaga ma le fesiitaiga o eletise e lagolagoina ai le photosynthesis. O le fausaga muamua o le crystal o Rps. O le faʻataʻitaʻiga o le palustris RC-LH1 complex o le RC, o loʻo siʻomia e le 15 heterodimeric LH1 loops, lea e faʻalavelaveina e se porotini e le iloa e taʻua o le "Protein W" (14). Na mulimuli ane faʻailoaina le Protein-W o le RPA4402, o se porotini e leʻi faʻaaliaina le 10.5kDa ma le tolu transmembrane helices (TMH) na valoia (16). Matou te fautuaina e toe faaigoa le kene rpa4402 o loʻo faʻailoa mai ai le porotini W i le pufW ina ia ogatasi ma le faʻaigoaina e faʻaaogaina mo kene o loʻo faʻailoa mai ai vaega o le RC-L, M (pufL, pufM) ma le LH1α, β (pufA, pufB). O le mea e ofo ai, e naʻo le tusa ma le 10% o le RC-LH1 le protein-W, ma ua faʻaalia ai o le Rps. palustris e gaosia ai ni vaega eseese se lua o le RC-LH1. O iinei, matou te lipotia atu ai fausaga cryo-EM (cryo-EM) maualuga-resolution o vaega autu e lua, o le tasi e iai le porotini W ma le 14 αβ heterodimers, o le isi e aunoa ma le porotini W ma se 16 Heterodimer LH1 loop tapuni. O la matou fausaga o loʻo faʻatusalia ai se suiga laʻasaga i le malamalama i le vaega o le RC-LH1 o le Rps. palustris, aua ua matou iloiloina le faitau aofaʻi tutusa o ituaiga taʻitasi ma ua lava le resolution e faʻailoa manino ai peptide taʻitasi ma pigments faʻapipiʻi ma lipids ma quinones e fesoʻotaʻi. O le faʻatusatusaga o nei fausaga e faʻaalia ai o polotini TMH e tolu-W e leʻi maua i soʻo se isi RC-LH1 complex e oʻo mai i le taimi nei e faʻatupuina ai se auala quinone e faʻavavevave ai le fesuiaiga o le quinone/quinolone. Ua faʻailoa mai le tele o nofoaga e fusifusia ai lipid ma quinone, ma ua matou faʻaalia ai se suiga fou i le fausaga ina ua maeʻa le tuʻufaʻatasia o le quinone ma le RC, lea atonu e talafeagai mo le photosystem II (PSII) RC o meaola phototrophic oxygenated. O a matou sailiga e maua ai ni malamalamaga fou i le kinetics o le fusifusia ma le fesuiaiga o le quinone/quinolone i le RC-LH1 core complex o siama phototrophic violē.
Ina ia faafaigofieina se suʻesuʻega auiliili o vaega e lua o loʻo maua i le Rps. palustris, matou te vavaeeseina RC-LH1 taʻitasi e ala i metotia faʻakemikolo. O le vaega e leai se protein W (o le a taʻua i lalo o le ΔpufW) na faʻamamāina mai le ituaiga e leai se pufW gene (16), ma e naʻo le tasi le vaega RC-LH1 e mafai ona gaosia. O le vaega e iai le protein W e gaosia e se ituaiga. O le protein W o lenei ituaiga e suia i se 10x His tag i lona C-terminus, ina ia mafai ona tuʻufaʻatasia lelei le vaega e iai le protein W ma le tele o le protein W e leai se mea e ala i le taofia o le uʻamea. O le vaega e vavaeeseina lelei (16) Affinity Chromatography (IMAC).
E pei ona faʻaalia i le Ata 1, o vaega uma e lua o loʻo i ai ni vaega laiti e tolu o le RC (RC-L, RC-M ma le RC-H) o loʻo siʻomia e se antenna LH1. O le fausaga 2.80-A o le vaega e leai se porotini-W o loʻo faʻaalia ai le 16 αβ heterodimers, ma fausia ai se matasele tapuni LH1 e siʻomia atoa ai le RC, o le a taʻua i lalo o le vaega RC-LH116. O le fausaga 2.65Å o le vaega o loʻo i ai le porotini-W o loʻo i ai se 14-heterodimer LH1 ua faʻalavelaveina e le porotini-W, o le a taʻua i lalo o le RC-LH114-W.
(A ma le B) Fa'atusa o le luga o le vaila'au. (C ma le D) Pigmeni fa'apipi'i o lo'o fa'aalia i totonu o tootoo. (E ma le F) O fa'aputuga na matauina mai luga o le cytoplasmic o lo'o i ai peptides ma vaega LH1 o lo'o fa'atusalia i ata tifaga, ma ua fa'anumeraina i le itu taumatau mai le va o le porotini-W [e ogatasi ma le numera Rba. sphaeroides complex (13)]. Mo le LH1-α, o le lanu o le vaega porotini o le samasama; mo le LH1-β, o le lanu o le vaega porotini o le lanumoana; mo le porotini-W, o le porotini e mumu; mo le RC-H, o le cyan; mo le RC-L, o le Lanu Moli; mo le RC-M, magenta. O fa'aputuga o lo'o fa'atusalia e tootoo, o le lanumeamata e fa'atusalia ai mole mole BChl ma le BPh a, o le violē e fa'atusalia ai carotenoids, ma o le samasama e fa'atusalia ai mole mole UQ10. (G ma le H) Va'aiga fa'ateleina o le va o le porotini-W i le vaega tutusa o le RC-LH114-W complex (G) ma le RC-LH116 complex (H). O lo'o fa'aalia mea fa'atasi i le tulaga o le fa'atumuina o avanoa, o lo'o fa'aalia i le lanumoana le quinone chelated. O le va o le porotini-W e fa'ailoa mai e se laina lanumoana manifinifi i le (G), ma o pu laiti e sosolo ai le quinone/quinolol i luga o le mama LH116 e fa'ailoa mai e se laina uliuli manifinifi i le (H).
O le Ata 1 (A ma le B) o loʻo faʻaalia ai le RC o loʻo siʻomia e ni faʻasologa tatala pe tapuni o LH1αβ heterodimers, e tofu ma le fusifusia o BChl e lua ma le tasi le carotenoid (Ata 1, C ma le D). O suʻesuʻega ua mavae ua faʻaalia ai o le Rps o le LH1 complex. I le auala biosynthetic o le spirulina xanthin, o nei ituaiga o loʻo i ai ni vaega fefiloi o carotenoids (17). Peitaʻi, o le spiropyrroxanthin o le carotenoid sili ona pulea ma e faamalieina lona mafiafia. O le mea lea, na matou filifili ai e faʻataʻitaʻi le spiroxanthin i nofoaga uma e fusifusia ai le LH1. O alpha ma beta polypeptides o ni TMH taʻitasi ma ni vaega pito i fafo o le membrane pupuu (Ata 1, A, B, E, ma le F). E ui lava e leʻi matauina le mafiafia o le 17 residues i le C-terminus, ae na vaeluaina le alpha polypeptide mai le Met1 i le Ala46 i complexes uma e lua. Na faʻaitiitia le β polypeptide mai le Gly4 i le Tyr52 i le RC-LH116, ma mai le Ser5 i le Tyr52 i le RC-LH114-W. E leai se mafiafia o le 3 pe 4 N-terminal po'o le 13 C-terminal residues na matauina (Ata S1). O le su'esu'ega o le mass spectrometry o le mixed RC-LH1 complex na saunia mai le wild-type strain na fa'aalia ai o le vaega na misi o le taunuuga lea o le heterologous cleavage o nei peptides (Ata S1 ma le S2). Na matauina fo'i le N-terminal formylation o le α-Met1 (f). Na fa'aalia i le su'esu'ega o le α-peptide e aofia ai residues fMet1 i le Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, ma o le β-peptide e aofia ai residues Ser2 i le Ala53, lea e ogatasi lelei ma le low-temperature EM density map.
O le fa'amaopoopoina o le α-His29 ma le β-His36 e fa'afesaga'i ai BChls; o αβ heterodimer ta'itasi e fa'apotopoto fa'atasi ma ona tuaoi e fausia ai se matasele tatala (RC-LH114-W) po'o se matasele tapuni (RC-LH116) e si'omia ai le RC O le fa'asologa o pigment exciton coupled (Ata 1, C ma le D). Pe a fa'atusatusa i le fusi 877 nm o le RC-LH114-W, o le 880 nm absorption red shift o le RC-LH116 e 3 nm (Ata 2A). Peita'i, e toetoe lava tutusa le circular dichroism spectrum (Ata 2B), e fa'ailoa mai ai e ui lava o lo'o i ai se eseesega manino i le va o matasele tatala ma matasele tapuni, ae o le siosiomaga i le lotoifale o BChls e matua tutusa lava. O le absorption redshift atonu o se taunuuga o le fa'aitiitia o le gaioiga o le vevela ma le fa'ateleina o le mautu i luga o le matasele tapuni (18, 19), o le suiga i le pigment coupling e mafua mai i le matasele tapuni (20, 21), po'o se tu'ufa'atasiga o nei aafiaga e lua (11).
(A) O le fusi o le mitiia o le ultraviolet/va'aia/lata ane i le infrared, o ona tumutumu ua fa'ailogaina i a latou lanu tutusa ma fa'atulagaina i le tumutumu BPh i le 775 nm. (B) O le fusi o le dichroism lapotopoto ua fa'atulagaina i le mitiia o le BChl i le 805 nm. (C ma le D) O le fusi ΔA ua filifilia mai le fusi mitiia ua mae'a ona fofoina i le taimi o le RC-LH114-W complex (C) ma le RC-LH116 complex (D). Mo se fa'atusatusaga sili atu, o fusi uma ua fa'atulagaina i le ∆A o le −A i le 0.2 ps. (E) O le fua faatatau o le fa'ama'iina o le cytochrome c2 pe a uma ona fa'avevela i le i ai o le tele o le UQ2 (tagai i le Ata S8 mo fa'amatalaga mata). (F) I sela ua ola a'e i lalo o le malamalama maualalo, feololo po'o le maualuga (10, 30 po'o le 300μMm-2 s-1, i le fa'asologa), o le porotini W ma le RC-L subunits i le fa'amamāina o le complex ma le fua fa'atatau o le membrane ua vavae'eseina. Fuafua le tulaga o le porotini e ala i le SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ma le immunoassay (tagai i le Ata S9 mo faʻamatalaga mata). Fuafua le fua faatatau e faʻatatau i le RC-LH114-W complex ua faʻamamāina. O le fua faatatau stoichiometric o le RC-L i le porotini-W o le complex e 1:1.
O BChls i le tulaga 1 i le matasele αβ14 ua fa'aleagaina o le RC-LH114-W (Ata 1, A, C, ma le E) e latalata atu i le foa'i muamua a le RC (P) i le 6.8Å nai lo le BChls tutusa i le RC-LH116 (Ata 1, B, D, ma le F, ma le Ata S3); peita'i, o le fa'agasologa o le mitiia o vaega e lua e fa'aalia ai mo le RC-LH114-W ma le RC-LH116, o le taimi e fesiita'i ai le malosi fa'aosofia mai le LH1 i le RC e 40 ±4 ma le 44 ±3 ps (Ata 2). , C ma le D, Ata S4 ma le Laulau S2). E leai fo'i se eseesega tele i le fesiita'iga eletise i totonu o le RC (Ata S5 ma le tusitusiga fa'aopoopo e feso'ota'i i ai). Matou te masalomia o le feso'ota'iga vavalalata o le taimi e fesiita'i ai le malosi i le va o le LH1 ma le RC-P e mafua mai i le mamao tutusa, tulimanu ma le malosi gafatia o le tele o BChl i matasele e lua o le LH1. E foliga mai o le suʻesuʻeina o le mamanu o le malosi o le LH1 e oʻo atu ai i le mamao maualalo e le vave atu nai lo le fesiitaiga tuusaʻo o le malosi mai nofoaga e le o lelei i le RC. O le matasele tatala o le LH1 i le RC-LH114-W e ono i ai foʻi se gaioiga faʻavevela e le taua i lalo o tulaga maualalo o le vevela mo le auʻiliʻiliga o le fausaga, ma e umi atu le αβ14 ring conformation i le vevela o le potu mai le mamao o le pigmentation o βBChls i le tulaga o le RC 1.
O le RC-LH116 complex e aofia ai le 32 BChls ma le 16 carotenoids, ma o lona faatulagaga atoa e tutusa ma le mea na maua mai le Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) ma le green algae (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Ina ua maeʻa ona faʻatulagaina, na o ni nai eseesega laiti i tulaga o αβ heterodimers na matauina, aemaise lava le 1-5, 15, ma le 16 (Ata S6). O le iai o le protein-W e iai sona aafiaga tele i le fausaga o le LH1. O ona TMH e tolu e fesoʻotaʻi e ni loops pupuu, faʻatasi ai ma le N-terminal i le itu lumen o le complex ma le C-terminal i le itu cytoplasmic (Ata 1A ma le 3, A i le D). O le Porotini-W e tele lava ina lē mafai ona tafe le vai (Ata 3B), ma o le TMH2 ma le TMH3 e fegalegaleai ma le LH1αβ-14 e fausia ai se fogāeleele transmembrane (Ata 3, B ma le E i le G). O le vaega e aofia ai le tele o toega o Phe, Leu ma Val i le vaega o le transmembrane. O nei toega e faaputuina i amino acids hydrophobic ma pigments αβ-14. O nisi toega polar e fesoasoani foi i le fegalegaleaiga, e aofia ai le sootaga hydrogen i le va o le W-Thr68 ma le β-Trp42 i luga o le fogāeleele o le lua faigata (Ata 3, F ma le G). I luga o le fogāeleele o le cytoplasm, o le Gln34 e tuaoi ma le vaega keto o carotenoids αβ-14. E le gata i lea, o le mole mole n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) na aveesea, ma o lona siʻusiʻu hydrophobic ua faalautele atu i le vaega i le va o le porotini-W ma le αβ-14, ma atonu o loʻo i totonu o le tino le siʻusiʻu lipid. Na matou matauina foʻi o vaega o le C-terminal resolution o le porotini W ma le RCH e matuā vavalalata lava, ae e le o totonu o le lautele o le fausiaina o fegalegaleaiga faapitoa (Ata 1, A ma le E). Peitaʻi, atonu e iai fegalegaleaiga i totonu o amino acid C-terminal e leʻi foiaina o nei porotini e lua, lea e ono maua ai se auala mo le faʻafaigaluegaina o le porotini-W i le taimi o le faʻapotopotoga o le RC-LH114-W complex.
(A) O le Porotini-W, lea e feagai ma le fesoota'iga ma le LH1αβ14 i le foliga ata, e iai se filifili itu e foliga i le tootoo (mumu), o lo'o fa'aalia i se vaega o le ata o le malosiaga eletise (fogafale efuefu manino ma se tulaga o le fausaga e 0.13). (B) O le Porotini-W o lo'o fa'atusalia e se fogafale lanu hydrophobic. O vaega polar ma vaega ua molia o lo'o fa'aalia i le cyan, o vaega hydrophobic o lo'o fa'aalia i le pa'epa'e, ma o vaega e malosi le hydrophobic o lo'o fa'aalia i le moli. (C ma le D) O le Porotini-W o lo'o fa'atusalia i le ata, o lona fa'atulagaga e tutusa ma le (A) (C), ma fa'ata'amilomilo i le 180° (D). E tusa ai ma le tulaga i le fa'asologa, o mea e mafai ona iloa e fa'aaogaina se lanu nuanua, lea e lanumoana ai le N-terminal ma mumu ai le C-terminal. (E) Porotini-W i le va'aiga lava e tasi e pei o le (A), ma o mea i le fesoota'iga o le porotini-W:LH1 o lo'o fa'atusalia e tootoo ma fa'ailoga fa'apipi'i. (F) O le Porotini-W ua fa'ata'amilomilo i le 90° e fa'atatau i le (E) ma le LH1αβ14 i le ata fa'atusa, ma e fa'atatau i toega o le feso'ota'iga i le fa'atusa o le pa. O toega tautau mai le beta polypeptide ua fa'ailogaina. O le cofactor ua fa'aalia o se pa e fetaui ma le lanu o le Ata 1, o le β-DDM ua fa'aleagaina ua fa'aalia i le lanu efuefu, ma o le okesene ua fa'aalia i le lanu mumu. (G) O le va'aiga i le (F) ua fa'ata'amilomilo i le 180°, fa'atasi ai ma toega iloga o le alpha polypeptide ua fa'ailogaina.
Ua suia e le Protein-W se αβ heterodimer (le 15 i le Ata 1F), ma taofia ai le tapunia o le loop ma fa'asaga i luga o le muamua αβ heterodimers e tolu. Na matauina o le tulimanu maualuga o le fa'asaga i luga o le muamua αβ-1 heterodimer e fa'atatau i le ata masani o le 25° i le 29° (Ata 1, A ma le E), lea na fausia e le 2° i le 8° fa'asaga i luga o le αβ-1 i le RC A sharp contrast-LH116 (Ata 1, B ma le F). O le lona lua ma le lona tolu heterodimers e fa'asaga i luga i le 12° i le 22° ma le 5° i le 10°, i le fa'asologa. Ona o le steric hindrance o le RC, o le fa'asaga i luga o le αβ-1 e le aofia ai le pea lona lua o le αβ (lea e fetaui ma le 16th αβ i le Ata 1F), ma fausia ai se avanoa manino i le mama LH1 (Ata 1, A ma le E). Ona o le leai o ni αβ heterodimers se lua, faatasi ai ma le leiloa o BChl e fa ma carotenoids e lua, e leai se tasi o carotenoids e fusifusia i le αβ-1 subunit ua milo, ma iu ai ina maua se mama LH114-W o loʻo i ai le 13 carotenoids Vegetarian ma le 28 BChls. O faʻatatauga o le iugafono i le lotoifale o complexes e lua i le αβ1 i le 7 regions e maualalo ifo nai lo o le vaega o totoe o le LH1 loop, lea e ono atagia ai le plasticity inherent o le LH1 subunit e lata ane i le RC QB site (Ata 4).
O ata o le RC-LH114-W (A ma le B) ma le RC-LH116 (C ma le D) o loʻo faʻaalia mai le vaaiga tutusa i luga/itu (A ma le B) (A ma le C) ma le fogāeleele o le avanoa o loʻo i le Ata 1. (B ma le D). O ki lanu o loʻo faʻaalia i le itu taumatau.
Na o le isi lava vaega autu e iloga ai le 1:14 o le Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Peita’i, e leai se tutusa manino o le porotini W ma le PufX, ma e iai sona aafiaga tele i o la’ua fausaga LH1. O le PufX o se TMH e tasi ma se vaega cytoplasmic N-terminal e fegalegaleai ma le itu cytoplasmic o le vaega RC-H (13) i se tulaga e fetaui ma le Rps. palustris LH116αβ-16. E fausia e le PufX se auala mo le fesuiaiga o le quinone/quinolone i le va o le RC-LH1 ma le vaega cytochrome bcl ma e iai i vaega autu uma o le Rba. sphaeroides (13). E ui o le feso’ota’iga monomer-monomer o lo’o i totonu o le Rba. O le sphaeroides RC-LH1-PufX dimer o loʻo i le tulaga fusifusia o le porotini W i le RC-LH114-W, ma o le va na mafua mai i le PufX ma le porotini-W o loʻo i se tulaga tutusa (Ata S7A). O le va i le RC-LH114-W e ogatasi foʻi ma le auala quinone faʻapea (8) o le Pseudomonas rosea LH1, lea e fausia e peptides e le fesoʻotaʻi ma le porotini W poʻo le PufX (Ata S7B). E le gata i lea, o le auala quinone i le Blc. O le emerald green LH1 na fausia e ala i le aveeseina o le tasi γ subunit (7) o loʻo i ai i se tulaga tutusa (Ata S7C). E ui ina faʻatautaia e porotini eseese, o le foliga mai o nei auala quinone/quinolol i se tulaga tutusa i le RC-LH1 complex e foliga mai o se faʻataʻitaʻiga o le convergent evolution, e faʻaalia ai o le va na faia e le porotini W e ono galue o se auala quinone.
O le va i le LH114-W loop e mafai ai ona fausia se vaega o le membrane faifai pea i le va o le avanoa i totonu o le RC-LH114-W complex ma le bulk membrane (Ata 1G), nai lo le faʻafesoʻotaʻiina o vaega e lua e ala i se pu o le porotini e pei o porotini. O le RC-LH116 complex e tutusa ma se Tch. Needle-like complex ua tapunia (22) (Ata 1H). Talu ai o le sosolo o le quinone i totonu o le membrane e vave atu nai lo le sosolo i totonu o le auala porotini vaapiapi, o le LH114-W loop tatala e mafai ona faʻatagaina ai le vave o le RC turnover nai lo le LH116 loop ua tapunia, ma o le sosolo o le quinone i totonu o le RC atonu e sili atu ona faʻatapulaʻaina. Ina ia faʻataʻitaʻi pe aʻafia e le porotini W le liua o quinones e ala i le RC, na matou faia se cytochrome oxidation assay i luga o se tulaga patino o le ubiquinone 2 (UQ2) (o se analogue o le UQ10 masani ma se siʻusiʻu isoprene puʻupuʻu) (Ata 2E). E ui o le iai o le chelated quinone e faʻalavelaveina ai le saʻo o le fuafuaina o le foliga vaaia o le Michaelis constant (RC-LH114-W ma le RC-LH116 e talafeagai mo le 0.2±0.1μM ma le 0.5±0.2μM, i le faasologa), o le fua faatatau maualuga o le RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) e 28±5% sili atu nai lo le RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Na matou fuafuaina muamua o le porotini-W o loʻo iai i le tusa ma le 10% o le vaega autu (16); iinei, o le fua faatatau o le nofoia o sela tuputupu aʻe e le malamalama tele, malamalama feololo, ma malamalama maualuga e 15±0.6%, 11±1% ma le 0.9±0.5, i le faasologa % (Ata 2F). O le faatusatusaga o le tele o le spectrometry na faaalia ai o le faaopoopoina o le histidine tag e lei faaitiitia ai le tele o le porotini-W pe a faatusatusa i ituaiga vao (P = 0.59), o lea o nei tulaga e le o se mea na faia i le porotini-W ua suia (Ata S10). Peitai, o lenei nofoia maualalo o le porotini-W i le vaega RC-LH1 atonu e mafai ai e nisi RC ona fesuiaʻi i se saoasaoa faatelevaveina, ma faapea ona faaitiitia ai le fesuiaiga o le quinone/quinolone e lemu i le vaega RC-LH116. Na matou matauina o le fua faatatau maualuga o le nofoia o le malamalama e le ogatasi ma faamatalaga lata mai o le transcriptomics, lea e faailoa mai ai o le faʻaalia o le kenera pufW e faʻateleina i lalo o le malamalama malosi (Ata S11) (23). O le eseesega i le va o le pufW transcription ma le tuufaatasia o le protein-W i totonu o le RC-LH1 complex e fenumiai ma atonu e atagia ai le faatonutonuina faigata o le porotini.
I le RC-LH114-W, e 6 cardiolipin (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) ma le 29 mole mole β-DDM ua vaevaeina ma faʻataʻitaʻiina i totonu - 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ma le 12 βDDM. RC-LH116 (Ata 5, A ma le B). I nei fausaga e lua, e toetoe lava a iai le CDL i le itu cytoplasmic o le complex, ae o le POPC, POPG ma le β-DDM e tele lava ina iai i le itu luminal. E lua mole mole lipid ma detergent na vavaeʻeseina i le vaega αβ-1 i le αβ-6 o le RC-LH114-W complex (Ata 5A), ma e lima na vavaeʻeseina i le vaega tutusa o le RC-LH116 (Ata 5B). E tele atu lipids na maua i le isi itu o le vaega faigata, e tele lava CDL, na faaputuputu i le va o le RC ma le αβ-7 i le αβ-13 (Ata 5, A ma le B). O isi lipids ma vailaʻau faʻamama ua maeʻa ona faʻatulagaina o loʻo i fafo atu o le mama LH1, ma o filifili acyl ua maeʻa ona faʻatulagaina e faʻalautele i le va o vaega LH1, ua faʻailogaina muamua o le β-DDM i le RC-LH114-W, ma faʻamatalaina o le β-DDM i le RC A faʻafefiloi o le β-DDM ma le POPC-LH116. O tulaga tutusa o lipids chelating ma vailaʻau faʻamama i totonu o la tatou fausaga e faʻaalia ai o ni nofoaga e fusifusia ai e talafeagai i le tino (Ata S12A). O tulaga o mole mole tutusa i le Tch e iai foʻi le tutusa lelei. Gentle ma Trv. O le Strain 970 RC-LH1s (Ata S12, B i le E) (9, 12) ma le hydrogen-bonding residues o le lipid head group na faaalia ai le lelei o le puipuiga i le faatulagaga o le faasologa (Ata S13), ma faailoa mai ai o le Conserved CDL e fusifusia i le RC (24), o nei nofoaga e ono faasaoina i le RC-LH1 complex.
(A ma le B) O peptides RC-LH114-W (A) ma le RC-LH116 (B) o loʻo faʻatusalia e ata faʻataʻitaʻi, ma o pigments o loʻo faʻatusalia e rods, e faʻaaoga ai le lanu i le Ata 1. O lipids o loʻo faʻaalia i le lanu mumu, ma o detergents o loʻo faʻaalia i le lanu efuefu. O le UQ e fusifusia i nofoaga o le RC QA ma le QB e samasama, aʻo le UQ tuʻufua e lanumoana. (C ma le D) O vaaiga tutusa e pei o le (A) ma le (B), faʻatasi ai ma lipids ua aveese. (E i le G) Vaʻaiga faʻalauteleina o le Q1(E), Q2(F) ma le Q3(G) mai le RC-LH116, faʻatasi ai ma filifili itu e aʻafia ai le tasi ma le isi. O fusifusia o le haitorosene o loʻo faʻaalia o ni laina uliuli manifinifi.
I le RC-LH116, o le RC QA ma le QB UQ, ia e auai i le fesiitaiga o eletise i le faagasologa o le vavaeeseina o le eletise, ua faaleagaina i o latou nofoaga e fusifusia ai. Peitai, i le RC-LH114-W, e lei foia le QB quinone ma o le a talanoaina auiliili i lalo. I le faaopoopo atu i le QA ma le QB quinones, e lua mole mole UQ ua chelated (o loo i le va o mama RC ma le LH1) ua vaevaeina i le fausaga RC-LH114-W e tusa ai ma a latou vaega ulu ua foia lelei (o loo i le Q1 ma le Q2, i le faasologa). avanoa). Ata 5C). E lua iunite isoprene ua tofia i le Q1, ma o le faafanua o le mafiafia e foia ai le atoaga o siusiu isoprene e 10 o le Q2. I le fausaga o le RC-LH116, e tolu mole mole UQ10 ua chelated (Q1 i le Q3, Ata 5D) na foia, ma o mole uma e iai le mafiafia manino i le siusiu atoa (Ata 5, D i le G). I fausaga e lua, o tulaga o vaega ulu quinone o le Q1 ma le Q2 e matua tutusa lava (Ata S12F), ma e na'o le RC latou te fegalegaleai ai. O lo'o i ai le Q1 i le faitoto'a o le avanoa W o le RC-LH114-W (Ata 1G ma le 5, C, D ma le E), ma o lo'o i ai le Q2 e lata ane i le nofoaga e fusifusia ai le QB (Ata 5, C, D) ma le F). O toega o le L-Trp143 ma le L-Trp269 ua fa'asaoina e matua latalata lava i le Q1 ma le Q2 ma maua ai fegalegaleaiga π-stacking e ono mafai (Ata 5, E ma le F, ma le Ata S12). O le L-Gln88, 3.0 Å mai le okesene distal o le Q1, e maua ai se fusi malosi o le hydrogen (Ata 5E); o lenei toega e fa'asaoina i RC uma vagana ai le mafutaga sili ona mamao (Ata S13). O le L-Ser91 ua suia fa'apitoa mo le Thr i le tele o isi RCs (Ata S13), e 3.8 Angstroms mai le methyl oxygen o le Q1, ma atonu e maua ai ni fusiua hydrogen vaivai (Ata 5E). E foliga mai e leai se fegalegaleaiga fa'apitoa a le Q3, ae o lo'o i totonu o le vaega hydrophobic i le va o le RC-M subunit ma le LH1-α subunit 5 i le 6 (Ata 5, D ma le G). O le Q1, Q2 ma le Q3 po'o quinones chelated lata ane ua fa'amautuina fo'i i le Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ma le Blc. O le fausaga o le iris (9, 10, 12) e fa'asino i se nofoaga fa'asaoina o le auxiliary quinone binding i le RC-LH1 complex (Ata S12G). O UQ e lima ua pala i le RC-LH116 e ogatasi lelei ma le 5.8±0.7 o vaega taʻitasi ua fuafuaina e le chromatography vai maualuga (HPLC), ae o UQ e tolu ua pala i le RC-LH114-W e maulalo ifo nai lo le . O le tau fuaina o le 6.2±0.3 (Ata S14) e faʻaalia ai o loʻo i ai ni mole mole UQ e leʻi foiaina i le fausaga.
O polypeptides L ma M e le tutusa le foliga e tofu ma le lima TMH ma fausia ai se heterodimer e tu'ufa'atasia ai le tasi BChl dimer, lua BChl monomers, lua bacteriophage (BPh) monomers, ma le tasi non-Heme iron ma le tasi pe lua mole mole UQ10. E ala i le i ai o hydrogen bonds i luga o le terminal ketone group ma lona fa'aputuga ua iloa i Rps, ua tu'ufa'atasia ai carotenoids i le M-subunit, lea e ta'ua o le cis-3,4-dehydroorhodopin. Species (25). O le vaega pito i fafo o le membrane o le RC-H ua fa'amauina i le membrane e se tasi TMH. O le fausaga atoa o le RC e tutusa ma le tolu subunit RC o ituaiga e feso'ota'i (e pei o le Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). O macrocycles o BChl ma le BPh, le carotenoid backbone ma le non-heme iron e fefiloi i totonu o le resolution range o nei fausaga, e fa'apea fo'i le UQ10 head group i le QA site ma le QB quinone i le RC-LH116 (Ata S15).
O le maua o ni fausaga RC se lua ma ni fua faatatau eseese o le nofoia o le nofoaga QB ua maua ai se avanoa fou e suʻesuʻe ai suiga tutusa o le fausaga e o faatasi ma le fusifusia o le QB quinone. I le RC-LH116 complex, o le QB quinone o loʻo i le tulaga "proximal" ua fusifusia atoatoa (26), ae o le vavaeʻeseina o le RC-LH114-W e leai se QB quinone. E leai se QB quinone i le RC-LH114-W, o se mea e ofo ai aua o le complex e galue, e sili atu nai lo le RC-LH116 complex ma le QB quinone ua maeʻa ona faʻatulagaina. E ui o mama LH1 e lua e chelate pe tusa ma le ono quinones, e lima e maeʻa ona faʻatulagaina i le mama RC-LH116 ua tapunia, ae na o le tolu e faʻatapulaʻaina le faʻatulagaina i le mama tatala RC-LH114-W. O lenei faʻalavelave faʻatulagaina ua faʻateleina e ono atagia ai le vave suia o nofoaga RC-LH114-W QB, vave quinone kinetics i le complex, ma le faʻateleina o le ono mafai ona sopoʻia le LH1 loop. Matou te fautua atu o le leai o se UQ i le nofoaga o le RC QB o le RC-LH114-W atonu o se taunuuga o se vaega e sili atu ona lavelave ma sili atu ona gaoioi, ma o le nofoaga o le QB o le RC-LH114-W ua vave ona taofia i le fesuiaʻiga o le UQ. O le laasaga patino (ua tapunia le faitotoa i le nofoaga o le QB) o loʻo atagia mai ai le fausaga o lenei gaioiga.
A aunoa ma le QB, o le a iai le fa'ata'amilosaga o le L-Phe217 i se tulaga e le fetaui ma le fusifusia o le UQ10, aua o le a mafua ai se feto'ai fa'ale-spatial ma le iunite muamua o le isoprene o le si'usi'u (Ata 6A). E le gata i lea, o suiga tetele o le fausaga e manino lava, aemaise lava le helix de (helix pu'upu'u i le matasele i le va o le TMH D ma le E) lea e si'itia ai le L-Phe217 i le taga fusifusia o le QB ma le fa'ata'amilosaga o le L-Tyr223 (Ata 6A) Ina ia motusia le fusifusia o le hydrogen ma le fa'avae M-Asp45 ma tapuni le faitoto'a o le nofoaga fusifusia o le QB (Ata 6B). O le Helix de pivots i lona fa'avae, o le Cα o le L-Ser209 ua si'itia i le 0.33Å, a'o le L-Val221Cα ua si'itia i le 3.52Å. E leai ni suiga e mafai ona va'aia i le TMH D ma le E, ia e mafai ona fa'apipi'i i fausaga uma e lua (Ata 6A). E pei ona matou iloa, o le fausaga muamua lea i le RC masani e tapunia ai le nofoaga QB. O se faʻatusatusaga ma le fausaga atoa (QB-bound) e faʻaalia ai aʻo leʻi faʻaitiitia le quinone, e manaʻomia se suiga o le fausaga ina ia ulufale ai i le quinone. E feliuliuaʻi le L-Phe217 e fausia ai se fegalegaleaiga π-stacking ma le vaega ulu quinone, ma e see ese le helix i fafo, ma mafai ai e le skeleton o le L-Gly222 ma le filifili itu o le L-Tyr223 ona fausia se fesoʻotaʻiga fusiua haitorosene ma se fausaga fusiua haitorosene mautu (Ata 6, A ma le C).
(A) Ata fa'ata'ita'i o le hologram (L chain, moli/M chain, magenta) ma le apo (efuefu) fausaga, lea o lo'o fa'aalia ai mea taua i le foliga o se fa'atusa e pei o le tootoo. O le UQ10 o lo'o fa'atusalia e se pa samasama. O le laina togitogi e fa'ailoa mai ai fusi o le haitorosene na fausia i le fausaga atoa. (B ma le C) O le fa'atusa o le pito i luga o le apolipoprotein ma le fausaga atoa o le mama, o lo'o fa'ailoa mai ai le okesene o le itu o le L-Phe217 i le lanumoana ma le L-Tyr223 i le mumu. O le vaega L e moli; o vaega M ma le H e le'i valiina. (D ma le E) Apolipoprotein (D) ma le atoa (E) nofoaga o le RC QB [vali e (A) i le faasologa] ma Thermophilus thermophilus PSII (lanumeamata, lanumoana ma le quinone palasitika; PDB ID: 3WU2) Fa'atulaga (58).
E ui lava i le mea e le'i mafaufauina, e ui lava o lo'o maua ni fausaga o RC e leai ni QB e aunoa ma le LH1, ae o suiga o le fausaga na matauina i lenei su'esu'ega e le'i lipotia muamua. E aofia ai le fausaga o le fa'aitiitia o le QB mai le Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ma le Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), o nei mea uma e toetoe lava tutusa ma le fausaga atoa o le QB. O le su'esu'ega vavalalata o le 3PRC na fa'aalia ai o lo'o fusifusia molela'au fa'amama LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) i le faitoto'a o le tulaga QB, lea e ono taofia ai le toe fa'atulagaina i se fausaga tapuni. E ui lava e le pala le LDAO i le tulaga lava e tasi i le 1EYS po'o le 1OGV, o nei RC ua saunia e fa'aaoga ai le fa'amama lava e tasi ma o lea e ono maua ai le aafiaga tutusa. O le fausaga tioata o le Rba. O le Sphaeroides RC ua fa'apipi'iina fa'atasi ma le cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) e foliga mai fo'i o lo'o i ai se nofoaga tapuni QB. Peita'i, i lenei tulaga, o le vaega N-terminal o le RC-M polypeptide (e fegalegaleai ma le nofoaga fusifusia QB e ala i le fusifusia H o le Tyr residue i luga o le Q helix) e fa'aaogaina se fausaga e le masani ai, ma e le'i su'esu'eina atili le suiga o le fausaga QB (30). O le mea e fa'amautinoa ai, e le'i va'aia lenei ituaiga o fa'aletonu o le M polypeptide i le fausaga RC-LH114-W, lea e toetoe lava tutusa ma le vaega N-terminal o le RC-LH116 RC. E tatau fo'i ona maitauina ina ua mae'a ona fa'aumatia le antenna LH1 e fa'avae i luga o le detergent, na fa'aleleia ai le apolipoprotein RCs i le PDB, lea na fa'aumatia ai vaituloto quinone i totonu ma lipids i le va i le va o le RC ma le pito i totonu o le mama LH1 o lo'o siomia ai (31, 32). E tumau pea le galue o le RC auā e taofia ai mea uma e fesoasoani i le fa'agasologa o le sauniuniga, se'i vagana ai le QB quinone e mafai ona pala, lea e le mautu tele ma e masani ona leiloa i le taimi o le sauniuniga (33). E le gata i lea, ua iloa o le aveeseina o le LH1 ma lipids masani e fa'asolosolo malie mai le RC e mafai ona i ai se aafiaga i galuega, e pei o le fa'apu'upu'uina o le umi o le ola o le P+QB-state ua vavae'ese mai le totogi (31, 34, 35). O le mea lea, matou te mateina o le i ai o le mama LH1 i le lotoifale o lo'o siomia ai le RC atonu e fa'atumauina ai le nofoaga "tapuni" o le QB, ma fa'asaoina ai le siosiomaga i le lotoifale e lata ane i le QB.
E ui o le apolipoprotein (e aunoa ma le QB quinone) ma le fausaga atoa e na o ni ata se lua o le suiga o le nofoaga QB, nai lo se faasologa o mea na tutupu, ae o loo i ai faailoga e mafai ona taofia le fusifusia e taofia ai le toe fusifusia e le hydroquinone Ina ia taofia le taofiofia o le substrate. Atonu e eseese le fegalegaleaiga o le quinolol ma le quinone e lata ane i le nofoaga QB o le apolipoprotein, lea e mafua ai ona teena e le RC. Ua leva ona fautuaina o suiga o le fausaga e iai sona sao i le fusifusia ma le faaitiitia o quinones. Ua faaletonu le gafatia o RCs aisa e faaitiitia ai quinones pe a uma ona fetuutuunai i le pogisa (36); Ua faaalia e le X-ray crystallography o lenei faaleagaina e mafua mai i le maileia o QB quinones i se fausaga "distal" e tusa ma le 4.5 Å mai le tulaga galue proximal (26), 37). Matou te fautua atu o lenei fausaga fusifusia distal o se ata o le tulaga vaeluaga i le va o le apolipoprotein ma le fausaga atoa o le mama, lea e mulimuli mai i le fegalegaleaiga muamua ma le quinone ma le tatalaina o le nofoaga QB.
O le ituaiga II RC o loʻo maua i le PSII complex o nisi o siama phototrophic ma cyanobacteria, limu ma laʻau e iai le puipuiga faʻatulagaina ma le faʻatinoina (38). O le faʻatulagaina o le fausaga o loʻo faʻaalia i le Ata 6 (D ma le E) e faʻamamafa ai le tutusa i le va o PSII RCs ma le nofoaga QB o le bacterial RC complex. O lenei faʻatusatusaga ua leva ona avea ma faʻataʻitaʻiga mo le suʻesuʻeina o faiga fesoʻotaʻi vavalalata o le fusifusia ma le faʻaitiitia o le quinone. O lomiga muamua na fautua mai ai o suiga o le fausaga e o faʻatasi ma le faʻaitiitia o le PSII o quinones (39, 40). O le mea lea, i le mafaufauina o le puipuiga faʻatekonolosi o le RC, o lenei faiga fusifusia e leʻi vaʻaia muamua e mafai foʻi ona faʻaaogaina i le nofoaga QB o le PSII RC i laʻau phototrophic oxygenated.
O le Rps ΔpufW (pufW e leai se fa'ailoga e aveese) ma le PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ua fa'aalia mai le pufW locus masani). O le palustris CGA009 na fa'amatalaina i la matou galuega muamua (16). O nei ituaiga ma le matua isogenic wild-type na toe maua mai le pusaaisa e ala i le fa'asoloina o ni nai sela i luga o le PYE (ta'itasi 5 kalama lita -1) (teuina i le LB i le -80 °C, o lo'o i ai le 50% (w/v) glycerol) porotini, yeast extract ma le succinate) agar [1.5% (w/v)] plate. Na fa'asusu le plate i le po atoa i le pogisa i le vevela o le potu i lalo o tulaga anaerobic, ona fa'amalamalamaina lea i le malamalama pa'epa'e (~50 μmolm-2 s-1) na saunia e le OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) mo le 3 i le 5 aso se'ia o'o ina aliali mai se kolone e tasi. E fa'aaogaina se kolone e tasi e fa'asusu ai le 10 ml o le M22+ medium (41) fa'aopoopo i ai le 0.1% (w/v) casamino acids (o le a ta'ua i lalo o le M22). Sa totoina le fa'ato'aga i lalo o tulaga maualalo o le okesene i le pogisa i le 34°C ma luluina i le 180 rpm mo le 48 itula, ona fa'asusu lea o le 70 ml o le fa'ato'aga i lalo o tulaga lava e tasi mo le 24 itula. O se fa'ato'aga semi-aerobic e 1 ml le voluma e fa'aaogaina e fa'asusu ai le 30 ml o le M22 medium i totonu o se fagu tioata manino e 30 ml ma fa'avevela i le fa'avevela (~50μmolm-2 s-1) mo le 48 itula e ala i le malosi fa'amaneta mama. Ona fa'asusu lea o le 30 ml o le fa'ato'aga i le tusa ma le 1 lita o le fa'ato'aga i lalo o tulaga lava e tasi, lea na fa'aaogaina e fa'asusu ai le tusa ma le 9 lita o le fa'ato'aga e fa'amalamalamaina i le ~200 μmolm-2 s-1 mo le 72 itula. Sa seleseleina sela e ala i le centrifugation i le 7132 RCF mo le 30 minute, toe fa'asusu i totonu o le ~10 ml o le 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ma teuina i le -20°C se'ia o'o ina mana'omia.
A uma ona fa'a'aisa, fa'aopoopo ni tioata o le deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) ma papa e lua o le Roche holoenzyme protease inhibitor (Merck, UK) i totonu o sela ua toe fa'asusuina. I totonu o se sela e 20,000 psi French pressure (Aminco, USA), na fa'alavelaveina ai sela i le 8 i le 12 taimi. A uma ona aveese sela e le'i motusia ma otaota e le mafai ona soloia e ala i le centrifugation i le 18,500 RCF mo le 15 minute i le 4°C, ona fa'aputuina lea o le membrane mai le pigmented lysate e ala i le centrifugation i le 113,000 RCF mo le 2 itula i le 43,000°C. Lafoa'i le vaega e mafai ona soloia ma toe fa'asusu le membrane lanu i le 100 i le 200 ml o le 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ma fa'afefiloi se'ia leai ni mea e va'aia. O le membrane ua tautau na fa'a'ofuina i totonu o le 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, ISA) o lo'o i ai le 2% (w/v) β-DDM mo le 1 itula i le pogisa i le 4°C fa'atasi ai ma le fa'agae'etia mālie. Ona fa'a-centrifuge lea i le 70°C e fa'ata'ape'ape ai le 150,000 RCF i le 4°C mo le 1 itula e aveese ai mea e le mafai ona fa'a'ofuina.
O le membrane fa'amavaeina mai le ituaiga ΔpufW sa fa'aogaina i luga o le koluma fesuia'i ion DEAE Sepharose e 50 ml ma le tolu koluma voluma (CV) o le binding buffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) o lo'o i ai le 0.03% (w/v) β-DDM]. Fufulu le koluma i ni CV binding buffer se lua, ona fufulu lea o le koluma i ni binding buffer se lua o lo'o i ai le 50 mM NaCl. O le RC-LH116 complex sa fa'amamāina i se linear gradient o le 150 i le 300 mM NaCl (i totonu o le binding buffer) i le 1.75 CV, ma o le binding complex na totoe sa fa'amamāina i se binding buffer o lo'o i ai le 300 mM NaCl i le 0.5 CV. Aoina le fusi o le mitiia i le va o le 250 ma le 1000 nm, taofi le vaega ma le fua faatatau o le mitiia (A880/A280) e sili atu i le 1 i le 880 i le 280 nm, fa'afefiloi faalua i totonu o le buffer fusifusia, ma toe fa'aaoga le faiga lava e tasi i luga o le koluma DEAE I le fa'amamāina. Fa'afefiloi vaega ma fua faatatau A880/A280 e maualuga atu i le 1.7 ma fua faatatau A880/A805 e maualuga atu i le 3.0, faia le taamilosaga lona tolu o le fesuia'iga ion, ma taofi vaega ma fua faatatau A880/A280 e maualuga atu i le 2.2 ma fua faatatau A880/A805 e maualuga atu i le 5.0. O le vaega ua fa'amamāina fa'aitiiti sa fa'aputuina i le ~2 ml i totonu o le Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK), ma fa'atumu i luga o le Superdex 200 16/600 size exclusion column (GE Healthcare, US) o lo'o i ai le 200 mM NaCl buffer, ona fa'asusuina lea i totonu o le buffer lava e tasi i le 1.5 CV. Aoina le absorption spectra o le size exclusion fraction, ma fa'aputu le absorption spectra i le A880/A280 ratios i luga ole 2.4 ma le A880/A805 ratios i luga ole 5.8 i le 100 A880, ma fa'aaoga loa mo le sauniuniga po'o le teuina o le cryo-TEM grid. Taofi ile -80°C se'ia o'o ina mana'omia.
O le membrane fa'asusu mai le ituaiga PufW-His sa fa'aogaina i le 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose column (20 mM tris-HCl (pH 8.0) o lo'o i ai le 200 mM NaCl ma le 0.03% (w/w)) i totonu o le IMAC buffer (GE Healthcare). v) β-DDM]. Sa fufuluina le column i le lima CVs o le IMAC buffer, ona fa'aogaina lea o le lima CVs o le IMAC buffer o lo'o i ai le 10 mM histidine. O le core complex sa fa'amamāina mai le column i le lima IMAC buffers o lo'o i ai le 100 mM histidine. O le vaega o lo'o i ai le RC-LH114-W complex ua fa'aputuina i le ~10 ml i totonu o se tane fa'aoso ua fa'apipi'iina i se Amicon 100,000 MWCO filter (Merck, UK), fa'avaivaia 20 taimi i le binding buffer, ona fa'aopoopo lea i le 25 ml I le DEAE Sepharose column, e fa CVs ua fusifusia i le buffer ua fa'aaogaina muamua. Fufulu le koluma i ni CV binding buffers e fa, ona fa'amamā lea o le complex i luga o CVs e valu i luga o se linear gradient o le 0 i le 100 mM NaCl (i totonu o le binding buffer), ma CVs e fa o totoe o lo'o i ai le 100 mM binding buffer. O complexes o totoe na fa'amamāina i luga o le sodium chloride fa'atasi ai ma le A880/A280 ratio e maualuga atu i le 2.4 ma le A880/A805 ratio e maualuga atu i le 4.6 fractions na fa'aputuina i le ~2 ml i totonu o le Amicon 100,000 MWCO centrifugal filter, ma fa'atumuina i le 1.5 CV IMAC muamua. Na fa'apaleni e le Buffer le Superdex 200 16/600 size exclusion column, ona fa'amamāina lea i le buffer lava e tasi i luga o le 1.5 CV. Aoina le spectra mitiia o vaega e le aofia ai le tele ma fa'apotopoto le spectra mitiia i le fua fa'atatau A880/A280 i luga atu o le 2.1 ma le fua fa'atatau A880/A805 i luga atu o le 4.6 i le 100 A880, ia e fa'aaogaina loa mo le sauniuniga o le TEM grid fa'a'aisa pe teuina i le -80°C se'ia o'o i le taimi e mana'omia ai.
Sa fa'aaogaina se pusaaisa fa'asusu Leica EM GP e saunia ai ni grids TEM e maualalo le vevela. Sa fa'afefiloi le complex i le IMAC buffer i le A880 o le 50, ona fa'atumu lea o le 5μl i luga o se QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK) ua fa'amumuina ma ua mū (Agar Scientific, UK). Fa'asusu le grid i le 20°C ma le 60% o le susū mo le 30 sekone, ona solo lea ma fa'amago mo le 3 sekone, ona tineia lea i le vai ethane i le -176°C.
O faʻamaumauga o le RC-LH114-W complex na faʻamaumauina i luga o le eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) faʻatasi ai ma se Titan Krios microscope, lea e galue i le voltage faʻavavevave o le 300kV, faʻatasi ai ma le faʻateleina masani o le 130,000× ma le malosi o le- Filifili se va o le 20 eV. O se Gatan 968 GIF Quantum faʻatasi ai ma le K2 peak detector na faʻaaogaina e faʻamaumauina ai ata i le faiga faitau e aoina ai faʻamaumauga. O le tele o pixel ua faʻatulagaina o le 1.048Å, ma le fua faatatau o le inumaga o le 3.83 e-Å-2s-1. Na aoina le ata tifaga i le 11 sekone ma vaevaeina i ni vaega e 40. Faaaoga le vaega ua ufiufi i le kaponi e toe faʻatatau ai le microscope, ona aoina lea o ata tifaga e tolu i le pu. I le aofaʻi, e 3130 ata tifaga na aoina, faʻatasi ai ma tau o le defocus i le va o le -1 ma le -3μm.
O faʻamaumauga mo le RC-LH116 complex na aoina e faʻaaoga ai le microscope lava lea e tasi i le Asterbury Biostructure Laboratory (Iunivesite o Leeds, UK). Na aoina faʻamaumauga i le faiga faitau ma le faʻateleina o le 130 k, ma le tele o le pixel na faʻatulagaina i le 1.065 Å ma le fua o le 4.6 e-Å-2s-1. Na puʻeina le ata tifaga i le 12 sekone ma vaevaeina i vaega e 48. I le aofaʻi, e 3359 ata tifaga na aoina, faʻatasi ai ma tau o le defocus i le va o le -1 ma le -3μm.
O fa'agasologa uma o fa'amaumauga e fa'atinoina i le Relion 3.0 pipeline (42). Fa'aaoga le Motioncorr 2 (43) e fa'asa'o ai le gaioiga o le ave e ala i le fa'amamafaina o le fua, ona fa'aaoga lea o le CTFFIND 4.1 (44) e fuafua ai le CTF (contrast transfer function) parameter. O ata masani o le photomicrographs pe a uma nei la'asaga muamua o le fa'agasologa o lo'o fa'aalia i le Ata 2. S16. O le fa'ata'ita'iga filifiliga otometi e gaosia e ala i le filifilia lima o le tusa ma le 250 pixels o le 1000 vaega i totonu o se fa'avaa 250-pixel ma leai se fa'asinomaga lua-dimensional (2D) fa'avasegaga, ma teena ai na fa'avasegaga e fetaui ma le fa'aleagaina o fa'ata'ita'iga pe leai ni uiga e iloa. Ona faia lea o le filifiliga otometi i luga o ata maiko uma, ma o le RC-LH114-W e 849,359 vaega, ma o le RC-LH116 complex e 476,547 vaega. O vaega uma ua filifilia ua faia i ai ni taamilosaga se lua o le fa'avasegaga 2D e le o se fa'asinomaga, ma a mae'a ta'amilosaga ta'itasi, o vaega e fetaui ma le vaega o le kaponi, fa'aleagaina o fa'ata'ita'iga, leai ni foliga manino po'o ni vaega e matua fe'avea'i e te'ena, ma i'u ai i le 772,033 (90.9%) ma le 359,678 (75.5%) ) O vaega e fa'aaogaina mo le fa'avasegaga 3D o le RC-LH114-W ma le RC-LH116. O le fa'ata'ita'iga muamua o le fa'asinomaga 3D na gaosia e fa'aaoga ai le metotia o le stochastic gradient descent. I le fa'aaogaina o le fa'ata'ita'iga muamua o se fa'asinomaga, o vaega ua filifilia ua vaevaeina i ni vaega e fa i le 3D. I le fa'aaogaina o le fa'ata'ita'iga i lenei vaega o se fa'asinomaga, fa'atino le fa'aleleia 3D i luga o vaega i le vaega aupito tele, ona fa'aaoga lea o le faamama maualalo muamua 15Å e ufiufi ai le vaega o le solvent, fa'aopoopo 6 pixels o pito vaivai, ma fa'agasolo mulimuli ane pixels e fa'asa'o ai le galuega fa'aliliuina o le Gatan K2 peak Modulation o le masini su'esu'e pito i luga. Mo le seti o fa'amaumauga RC-LH114-W, o lenei fa'ata'ita'iga muamua na suia e ala i le aveeseina o le mafiafia malosi i pito o le ufimata (ua motusia mai le mafiafia autu i le UCSF Chimera). O fa'ata'ita'iga na maua mai ai (o iugafono o le RC-LH114-W ma le RC-LH116 e 3.91 ma le 4.16 Å, i le faasologa) e fa'aaogaina o se fa'asinomaga mo le taamilosaga lona lua o le fa'avasegaga 3D. O vaega na fa'aaogaina ua fa'aputuina i totonu o le vasega muamua 3D ma e leai se fesoota'iga malosi ma le tuaoi. Fe'avea'i pe leai fo'i ni foliga fa'atulagaina manino. A mae'a le taamilosaga lona lua o le fa'avasegaga 3D, o le vaega e sili ona maualuga le iugafono na filifilia [Mo le RC-LH114-W, o le tasi vaega o le 377,703 vaega (44.5%), mo le RC-LH116, e lua vaega, e aofa'i i le 260,752 vaega (54.7%), lea e tutusa ai pe a fa'atulagaina pe a uma le fa'ata'amilosaga muamua ma se eseesega la'ititi]. O vaega ua filifilia ua toe aveeseina i totonu o se pusa 400-pixel ma toe faaleleia e ala i le 3D refining. O le solvent mask e gaosia e ala i le faaaogaina o le 15Å low-pass filter muamua, 3 pixel map expansion ma le 3 pixel soft mask. O le faaaogaina o le per-particle CTF refinement, per-particle motion correction correction ma le taamilosaga lona lua o le per-particle CTF refinement, 3D refinement, solvent masking ma le post-processing e faia pe a uma laasaga taitasi e faaleleia atili ai le texture e maua. I le faaaogaina o le FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off value o le 0.143, o iugafono o faataitaiga mulimuli o le RC-LH114-W ma le RC-LH116 e 2.65 ma le 2.80Å, i le faasologa. O le FSC curve o le faataitaiga mulimuli o loo faaalia i le Ata 2. S17.
O fa'asologa uma o porotini e sii maia mai le UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Porotini-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) na fa'aaogaina e fausia ai se fa'ata'ita'iga tutusa o le RC, lea e aofia ai fa'asologa o porotini o le RC-L, RC-M ma le RC-H ma le fausaga tioata o le Rba. sphaeroides RC na fa'aaogaina o se fa'ata'ita'iga (PDB ID: 5LSE) (46). Faaaoga le meafaigaluega "fit map" i le UCSF Chimera e fa'afetaui ai le fa'ata'ita'iga ua gaosia i le fa'afanua (47), fa'aleleia le fausaga o le porotini, ma le cofactor [4×BChl a (igoa o le toega o le faletusi monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), tasi pe lua ituaiga o UQ10 (U10), tasi le non-heme iron (Fe) ma le tasi le 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] fa'aaoga le Coot (48) e fa'aopoopo ai. Talu ai e le maua le QAK i le faletusi monomer, na fa'atulagaina fa'apitoa e fa'aaoga ai le meafaigaluega eLBOW i le PHENIX (49).
Sosoo ai, na fausia le vaega LH1. I le amataga, o le meafaigaluega faufale otometi i le PHENIX (49) na faʻaaogaina e fausia otometi ai se vaega o le faasologa o le LH1 e faʻaaoga ai le faʻafanua ma le faasologa o porotini LH1-α ma le LH1-β e fai ma faʻamatalaga. Filifili le vaega LH1 sili ona atoatoa, aveese ma uta i totonu o le Coot, faʻaopoopo lima le faasologa o loʻo misi i totonu, ma faʻaleleia lima le fausaga atoa aʻo leʻi faʻaopoopoina ni BCl se lua (BCL) ma se spirilloxanthin (CRT) [e tusa ai ma le Rps talafeagai O le mafiafia o le LH1 complex ma le mea ua iloa o loʻo i ai le carotenoid. Species (17)]. Kopi le vaega LH1 atoa, ma faʻaaoga le UCSF Chimera "Docking Map Tool" e faʻapipiʻi ai i le vaega e le o se faʻataʻitaʻiga o le mafiafia o le LH1, ona faʻaleleia lea i le Coot; toe fai le faiga seʻia maeʻa ona faʻataʻitaʻiina vaega LH1 uma. Mo le fausaga o le RC-LH114-W, e ala i le aveeseina o le unallocated density i le Coot, e vaevaeina le porotini mai vaega e le o ni porotini o totoe i le USCF Chimera map ma e faʻaaogaina le meafaigaluega Autobuild e faʻatuina ai le faʻataʻitaʻiga muamua, ma vaega o totoe (protein-W) Modeling. I le PHENIX (49). Faʻaopoopo soʻo se faʻasologa o loʻo misi i le faʻataʻitaʻiga i le Coot (48), ona faʻaleleia lea ma le lima le vaega atoa. O le vaega o totoe e leʻi faʻatulagaina e fetaui ma le tuʻufaʻatasiga o lipids (PDB monomer library ID o le CDL = CDL, POPC = 6PL ma le POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) ma mole mole UQ10 (U10). Faʻaaoga le PHENIX optimization (49) ma le manual optimization i le Coot (48) e faʻaleleia atili ai le faʻataʻitaʻiga muamua atoa seʻia oʻo ina le mafai ona faʻaleleia atili fuainumera o le faʻataʻitaʻiga ma le tulaga vaaia o le fetaui. Mulimuli ane, faʻaaoga le LocScale (50) e faʻaleleia atili ai le local map, ona faʻatino lea o isi taʻamilosaga o le faʻataʻitaʻiina o le unallocated density ma le automatic ma le manual optimization.
O peptides, cofactors ma isi lipids ma quinones o loʻo faʻapipiʻi i totonu o latou densities taʻitasi o loʻo faʻaalia i Ata 1 ma le 2. S18 i le S23. O faʻamatalaga faʻamaumauga o le faʻataʻitaʻiga mulimuli o loʻo faʻaalia i le Laulau S1.
Se'i vagana ua fa'amaoti mai, o le UV/Vis/NIR absorption spectra na aoina i luga o le Cary60 spectrophotometer (Agilent, ISA) i le va o le 1 nm mai le 250 nm i le 1000 nm ma se taimi fa'apipi'i o le 0.1s.
Fa'asu'i le fa'ata'ita'iga i totonu o se quartz cuvette ma se auala e 2 mm i le A880 o le 1, ma aoina le absorption spectrum i le va o le 400 ma le 1000 nm. O le circular dichroic spectra na aoina i luga o le Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Iapani) i le 1 nm va i le va o le 400 nm ma le 950 nm i le scan rate o le 20 nm min-1.
O le molar extinction coefficient e fuafua e ala i le fa'avaivaia o le core complex i le A880 e tusa ma le 50. Fa'avaivaia le 10μl voluma i le 990μl binding buffer po'o le methanol, ma aoina loa le absorption spectrum e fa'aitiitia ai le fa'aleagaina o le BChl. O le aofa'i o le BChl o fa'ata'ita'iga ta'itasi o le methanol na fuafuaina e ala i le extinction coefficient i le 771 nm o le 54.8 mM-1 cm-1, ma na fuafuaina le extinction coefficient (51). Vaevae le BChl concentration na fuaina i le 32 (RC-LH114-W) po'o le 36 (RC-LH116) e fuafua ai le core complex concentration, lea e fa'aaogaina e fuafua ai le absorption spectrum o le fa'ata'ita'iga lava e tasi na aoina i le buffer Extinction coefficient. tutusa. E tolu fua na faia mo fa'ata'ita'iga ta'itasi, ma o le averesi o le absorbance o le BChl Qy maximum na fa'aaogaina mo le fuafuaina. O le fua fa'atatau o le fa'aumatia o le RC-LH114-W na fuaina i le 878 nm o le 3280±140 mM-1 cm-1, ae o le fua fa'atatau o le fa'aumatia o le RC-LH116 na fuaina i le 880 nm o le 3800±30 mM-1 cm-1.
Sa fuaina le UQ10 e tusa ai ma le metotia i le (52). I se aotelega, o le reverse phase HPLC (RP-HPLC) sa faia e faʻaaoga ai le Agilent 1200 HPLC system. Fa'afefiloi pe tusa ma le 0.02 nmol o le RC-LH116 po'o le RC-LH114-W i le 50μl o le 50:50 methanol:chloroform o lo'o i ai le 0.02% (w/v) ferric chloride, ma tuiina le Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ua uma ona fa'atusatusaina. Fa'afefiloi i le 1 ml-1 min-1 i le 40°C i le HPLC solvent (80:20 methanol:2-propanol) i luga o le ×25 cm column. Fa'atino le isocratic elution i totonu o le HPLC solvent e mata'ituina ai le absorbance i le 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) ma le 780 nm (BChl) mo le 1 itula. O le tumutumuga i le chromatogram 275 nm i le 25.5 minute na tu'ufa'atasia, lea e le'i i ai ni isi vaila'au e mafai ona iloa. O le vaega tu'ufa'atasia e fa'aaogaina e fuafua ai le aofa'i molar o le UQ10 na fa'a'esea e fa'atatau i le pi'o fa'atulagaina na fuafuaina mai le tuiina o tulaga mama mai le 0 i le 5.8 nmol (Ata S14). O fa'ata'ita'iga ta'itasi na su'esu'eina i ni toe faia se tolu, ma o le mea sese na lipotia e fetaui ma le SD o le averesi.
O se vaifofo o loʻo i ai le RC-LH1 complex ma le maualuga o le Qy absorption o le 0.1 na saunia i le 30 μM reduced horse heart cytochrome c2 (Merck, UK) ma le 0 i le 50 μMUQ2 (Merck, UK). E tolu faʻataʻitaʻiga 1-ml na saunia i le UQ2 taʻitasi ma faʻasusu i le po i le pogisa i le 4°C e faʻamautinoa ai le fetuʻunaʻi atoatoa i le pogisa aʻo leʻi fuaina. Na utaina le vaifofo i totonu o se OLIS RSM1000 modular spectrophotometer ua faʻapipiʻiina i se 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm middle ma le 0.6 mm outlet slits. O se 600 nm long pass filter ua tuʻuina i le faitotoʻa o le sample phototube ma le reference photomultiplier tube e taofia ai le malamalama faʻaosofia. Na mataʻituina le absorbance i le 550 nm ma se taimi faʻapipiʻi o le 0.15 s. O le malamalama fa'aosofia e fa'asalalauina mai le 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) e ala i se uaea fiber optic i le 90% le malosi e ala i se DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) ma e fa'asalalauina atu i le puna o le malamalama i le tulimanu e 90° o le. O le ave fua e fa'asaga i le fa'ata e toe fa'afo'i mai ai so'o se malamalama e le'i mitiia muamua e le fa'ata'ita'iga. Mata'ituina le absorbance 10 s a'o le'i o'o i le fa'amalamalamaina o le 50 s. Ona toe mata'ituina lea o le absorbance mo le 60 s i le pogisa e iloilo ai le tele o le quinolol e fa'aitiitia ai le cytochrome c23 + (tagai i le Ata S8 mo fa'amatalaga mata).
Sa fa'agasoloina fa'amaumauga e ala i le fa'afetauiina o se fua fa'atatau muamua laina i totonu ole 0.5 i le 10 s (e fuafua i le maualuga o le UQ2) ma le fa'atatauina o fua fa'atatau o fa'ata'ita'iga uma e tolu i le maualuga o le UQ2 ta'itasi. O le maualuga o le RC-LH1 na fuafuaina e le fua fa'atatau o le fa'aumatiaga na fa'aaogaina e liua ai le fua fa'atatau i le lelei o le fa'aosofiaga, na fa'atusaina i le Origin Pro 2019 (OriginLab, ISA), ma fa'afetaui i le fa'ata'ita'iga a Michaelis-Menten e fuafua ai tau manino o le Km ma le Kcat.
Mo fua fa'atatau o le mitiia fa'afuase'i, o le fa'ata'ita'iga RC-LH1 na fa'avaivaia i le ~2μM i le IMAC buffer o lo'o i ai le 50 mM sodium ascorbate (Merck, ISA) ma le 0.4 mM Terbutin (Merck, ISA). O le ascorbic acid e fa'aaogaina o se foa'i eletise fa'ataulaga, ma le tert-butaclofen e fa'aaogaina o se QB inhibitor e fa'amautinoa ai o le foa'i RC autu e tumau pea le fa'aitiitia (o lona uiga, e le o le photooxidized) i le faagasologa atoa o le fuaina. E tusa ma le 3 ml o le fa'ata'ita'iga e fa'aopoopo i se sela fa'ata'amilomilo fa'apitoa (pe tusa ma le 0.1 m le lautele, 350 RPM) fa'atasi ai ma le 2 mm le umi o le auala opitika e fa'amautinoa ai o le fa'ata'ita'iga i le auala laser e lava le taimi mo le fetu'una'iga pogisa i le va o pulses fa'aosofia. Fa'aaoga ~100-fs laser pulses e fa'amalosia ai le Ti: Sapphire laser system (Spectra Physics, ISA) e fa'aosofia ai le fa'ata'ita'iga i le 880 nm i le fua fa'atatau o le 1 kHz (20 nJ mo NIR po'o le 100 nJ mo Vis). A'o le'i aoina fa'amaumauga, fa'aali le fa'ata'ita'iga i le malamalama fa'aosofia mo le tusa ma le 30 minute. O le fa'aalia o le a mafua ai ona le toe fa'agaoioia le QA (atonu e fa'aitiitia le QA fa'atasi pe fa'alua). Ae fa'amolemole ia matau o lenei faiga e mafai ona toe fa'afo'isia aua a mae'a se taimi umi o le fetu'una'i i le pogisa, o le a toe fo'i malie le RC i le gaioiga QA. O se Helios spectrometer (Ultrafast Systems, ISA) na fa'aaogaina e fuaina ai le transient spectra ma se taimi fa'atuai e -10 i le 7000 ps. Fa'aaoga le polokalama Surface Xplorer (Ultrafast Systems, ISA) e fa'avasega ai seti o fa'amaumauga, ona tu'ufa'atasia lea ma fa'atulagaina. Fa'aaoga le afifi polokalama CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) e fa'aaoga ai le seti o fa'amaumauga tu'ufa'atasi e maua ai le eseesega o spectra e feso'ota'i ma le pala, pe fa'aaoga se galuega e fa'apotopoto ai le tele o exponents ma le tali a le meafaigaluega e fetaui ma le evolusione o le spectral o le wavelength e tasi i le Origin (OriginLab, ISA).
E pei ona ta'ua i luga (53), o se ata tifaga photosynthetic o lo'o i ai le LH1 complex e leai ni RC ma ni peripheral LH2 antenna na saunia. Na fa'avaivaia le membrane i le 20 mM tris (pH 8.0) ona fa'atumu lea i totonu o se quartz cuvette ma se auala opitika 2 mm. O se 30nJ laser pulse na fa'aaogaina e fa'aosofia ai le fa'ata'ita'iga i le 540 nm fa'atasi ai ma se taimi fa'atuai o le -10 i le 7000 ps. Fa'agasolo le seti o fa'amaumauga e pei ona fa'amatalaina mo le Rps. pal sample.
Sa fa'apalapala le membrane e ala i le centrifugation i le 150,000 RCF mo le 2 itula i le 4°C, ona toe fa'asusu lea o lona mitiia i le 880 nm i le 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ma le 200 mM NaCl. Fa'a'asu le membrane e ala i le fa'aoso malie i le 2% (w/v) β-DDM mo le 1 itula i le pogisa i le 4°C. Sa fa'a'asu le fa'ata'ita'iga i le 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) i se fa'aputuga porotini e 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). Sa fa'atinoina isi fa'agasologa mai le metotia na lolomiina muamua (54), e amata i le fa'a'asu o le 50 μg porotini i totonu o le aofa'i e 50 μl TEAB o lo'o i ai le 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). A maeʻa le sonication mo le 60 sekone, ona faʻaitiitia lea i le 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) i le 37°C mo le 30 minute. Mo le S-alkylation, faʻasusu le faʻataʻitaʻiga i le 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ma faʻaopopo mai se 200 mM isopropanol stock solution mo le 10 minute i le vevela o le potu. Sa faʻatinoina le proteolytic digestion e ala i le faʻaopoopoina o le 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mixture (Promega UK) ma faʻasusu i le 37°C mo le 3 itula. Sa faʻaʻesea le laurate surfactant e ala i le faʻaopoopoina o le 50 μl ethyl acetate ma le 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ma le vortexing mo le 60 sekone. Sa faʻalauteleina le vaevaega o le vaega e ala i le centrifugation i le 15,700 RCF mo le 5 minute. E tusa ai ma le faiga fa'avae a le kamupani gaosi oloa, o le koluma vili C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) na fa'aaogaina e mitiia ma aveese ai le masima i le vaega pito i lalo o lo'o i ai le peptide. Ina ua mae'a ona fa'amago i le vacuum centrifugation, ona fa'a'asu lea o le fa'ata'ita'iga i le 0.5% TFA ma le 3% acetonitrile, ma le 500 ng na au'ili'iliina e ala i le nanoflow RP chromatography fa'atasi ai ma le mass spectrometry e fa'aaoga ai fa'atulagaga o le faiga na fa'amatalaina muamua.
Faaaoga le MaxQuant v.1.5.3.30 (56) mo le faailoaina ma le fuaina o porotini e su'e ai le fa'amaumauga o le Rps. palustris proteome (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). O fa'amaumauga o le mass spectrometry proteomics ua teuina i le ProteomeXchange Alliance e ala i le PRIDE partner repository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) i lalo o le dataset identifier PXD020402.
Mo le su'esu'ega e ala i le RPLC fa'atasi ai ma le electrospray ionization mass spectrometry, o le RC-LH1 complex na saunia mai le wild-type Rps. I le fa'aaogaina o le metotia na lolomiina muamua (16), o le maualuga o le porotini na gaosia i totonu o sela palustris o le 2 mg ml-1 i le 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl ma le 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM. E tusa ai ma le protocol a le kamupani gaosi oloa, fa'aaoga le 2D purification kit (GE Healthcare, USA) e aveese ai le 10 μg porotini e ala i le precipitation method, ma fa'a'a'a le precipitate i le 20 μl 60% (v/v) formic acid (FA), 20% (v/v) Acetonitrile ma le 20% (v/v) vai. E lima microliters na su'esu'eina e ala i le RPLC (Dionex RSLC) fa'atasi ai ma le mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Faaaoga le koluma MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) mo le vavaeeseina i le 60°C ma le 100μlmin -1, faatasi ai ma le gradient o le 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA ma le 0.02% (V/v) TFA aqueous solution] i le 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA ma le 0.02%(v/v) i le 90%(v/v) acetonitrile TFA] I le faaaogaina o le electrospray ionization source masani ma parameters masani mo le silia ma le 60 minute, e maua ai e le mass spectrometer le 100 i le 2750 m/z (mass-to-charge ratio). Faatasi ai ma le fesoasoani a le ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), faafanua le mass spectrum i subunits o le complex.
Sa fa'atupuina sela mo le 72 itula i lalo o le 100 ml NF-maualalo (10μMm-2 s-1), feololo (30μMm-2 s-1) po'o le maualuga (300μMm-2 s-1) malamalama. M22 feololo (M22 feololo lea e aveese ai le ammonium sulfate ma suia le sodium succinate i le sodium acetate) i totonu o se fagu 100 ml e fa'apipi'i i luga o se uili (23). I ta'amilosaga e lima e 30-s, o pulu tioata 0.1 micron na fa'apipi'iina i le fua fa'atatau o le voluma o le 1:1 e fa'amaluluina ai sela ma fa'amālūlūina i luga o le aisa mo le 5 minute. O mea e le mafai ona soloia, sela e le'i gauia ma pulu tioata na aveese e ala i le centrifugation i le 16,000 RCF mo le 10 minute i totonu o se microcentrifuge benchtop. Sa vavaeeseina le membrane i totonu o le Ti 70.1 rotor faatasi ai ma le 100,000 RCF i le 20 mM tris-HCl (pH 8.0) faatasi ai ma le 40/15% (w/w) sucrose gradient mo le 10 itula.
E pei ona faamatalaina i la matou galuega muamua, o le puipuiga o le tino (immunodetection) o le His tag i luga o le PufW (16). I se aotelega, o le fa'amamāina o le core complex (11.8 nM) po'o le membrane o lo'o i ai le tutusa o le RC (fuafuaina e ala i le oxidation e to'esea ai le reduced difference spectrum ma fa'afetaui le avega i luga o le gel ua valiina) i totonu o le 2x SDS loading buffer (Merck, UK) ua fa'avaivaia fa'alua. O porotini na vaevaeina i luga o se replica 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). O se gel na valiina i le Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) e uta ma va'ai ai i le RC-L subunit. O le porotini i luga o le gel lona lua na fa'aliliuina i le methanol-activated polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, UK) mo le immunoassay. Sa poloka le membrane PVDF i le 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 ma le 5% (w/v) susu pa'u ua le lava le kulimi, ona fa'afefiloi lea ma le antibody muamua o le anti-His (i le Fa'asu'u le antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl ma le 0.05% (v/v) Tween-20] i le 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ISA) mo le 4 itula. A maeʻa ona fufuluina faatolu mo le 5 minute i le antibody buffer, ona faʻapipiʻi lea o le membrane ma le horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (faʻavaivaia 1:10,000 i le antibody buffer) Faʻasusu ina ia mafai ai ona iloa (5 minute pe a uma ona fufuluina faatolu i le antibody buffer) e faʻaaoga ai le WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italia) ma le Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
I le tusiaina o le tufatufaina o le malosi o gel taʻitasi ua valiina poʻo le immunoassay lane, tuʻufaʻatasia le vaega i lalo o le tumutumu ma fuafua le fua faatatau o le malosi o le RC-L (gel ua valiina) ma le Protein-W (immunoassay), i le ImageJ (57) Faʻagasolo le ata. O nei fua faatatau na liua i fua faatatau molar e ala i le manatu o le fua faatatau o le RC-L i le porotini-W i le faʻataʻitaʻiga mama RC-LH114-W e 1:1 ma faʻatulagaina le seti atoa o faʻamaumauga e tusa ai.
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O le fausaga maualuga le iugafono o le light trap 1 complex i le nofoaga autu o tali atu ua maua ai ni malamalamaga fou i le gaioiga o le quinone.
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©2021 American Association for the Advancement of Science. aia tatau uma ua taofia. AAAS ose paaga a HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ma COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.