Nei *Tuatusi o loʻo iai nei: Cologne 50931, Siamani, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
O le fa'aleagaina o le tino o fa'ama'i mitochondrial e manatu e le mafai ona toe fa'afo'isia ona o le metabolism plasticity o neurons e fa'atapula'aina, ae o le a'afiaga o le fa'aletonu o le mitochondrial i le tuto'atasi o le sela o le metabolism neuronal i le tino e le o malamalama lelei i ai. O iinei, matou te fa'alauiloaina ai le proteome fa'apitoa o le sela o neurons Purkinje ma le fa'aletonu o le OXPHOS e mafua mai i le fa'alavelaveina o le mitochondrial fusion dynamics. Na matou iloa ai o le fa'aletonu o le mitochondrial na mafua ai se suiga tele i le matata o proteomics, lea na iu ai ina i'u i le fa'agaoioiga fa'asolosolo o polokalame metabolic sa'o a'o le'i oti le sela. E le'i mafaufauina, na matou iloa ai le fa'aosofia manino o le pyruvate carboxylase (PCx) ma isi enzymes e tete'e i le matua e fa'aopoopo i vaega o le ta'amilosaga TCA. O le taofia o le PCx na fa'ateteleina ai le atuatuvale o le oxidative ma le neurodegeneration, e fa'ailoa mai ai o le atherosclerosis e iai sona a'afiaga puipuia i neurons e leai se OXPHOS. O le toe fa'afo'isia o le mitochondrial fusion i neurons ua fa'aleagaina e matua'i suia ai nei uiga metabolic, ma puipuia ai le oti o le sela. O a matou su'esu'ega e fa'ailoa ai auala e le'i iloa muamua e maua ai le malosi i le fa'aletonu o le mitochondrial ma fa'aalia ai e mafai ona toe fa'afo'isia le neurodegeneration e o'o lava i tulaga mulimuli o le fa'ama'i.
O le matafaioi autū a le mitochondria i le tausia o le metabolism o le malosi o neula e faʻamamafaina e faʻailoga tetele o neula e fesoʻotaʻi ma faʻamaʻi mitochondrial o tagata. O le tele o nei faʻamaʻi e mafua mai i fesuiaʻiga o kene e faʻatonutonuina ai le faʻaalia o kene o le mitochondrial (1, 2) poʻo le faʻaumatia o kene e fesoʻotaʻi ma le mitochondrial dynamics, lea e aʻafia ai le mautu o le mitochondrial DNA (mtDNA) (3, 4). O galuega i faʻataʻitaʻiga o manu ua faʻaalia ai o le tali atu i le faʻaletonu o le mitochondrial i aano o loʻo siomia ai, e mafai ona faʻagaoioia auala faʻasao o le metabolism (5-7), lea e maua ai faʻamatalaga taua mo le malamalama loloto i le pathogenesis o nei faʻamaʻi faigata. I se faʻatusatusaga matuia, o lo tatou malamalama i suiga o le metabolism o ituaiga sela patino e mafua mai i le le manuia lautele o le gaosiga o le adenosine triphosphate (ATP) o le faiʻai e taua tele (8), ma faʻamamafa ai le manaʻomia ona faʻailoa ni faʻamoemoega faʻamalolo e mafai ona faʻaaogaina e puipuia ai pe puipuia ai faʻamaʻi. Puipuia le neurodegeneration (9). O le leai o faʻamatalaga o le mea moni e manatu lautele sela neula e matua faʻatapulaʻaina le fetuʻunaʻi o le metabolism pe a faʻatusatusa i ituaiga sela o aano o loʻo siomia ai (10). Ona o nei sela e iai se matafaioi autū i le faʻamaopoopoina o le sapalai o metabolites i neurons e faʻalauiloa ai le synaptic transmission ma tali atu i manuʻaga ma faʻamaʻi, o le gafatia e fetuʻunaʻi ai le metabolism o sela i tulaga faigata o le aano o le faiʻai e toetoe lava a faʻatapulaʻaina i sela glial (11-14). E le gata i lea, o le heterogeneity o sela o le faiʻai e tele lava ina faʻalavelaveina ai le suʻesuʻeina o suiga o le metabolism e tutupu i vaega faʻapitoa o neurons. O se taunuuga, e itiiti se mea e iloa e uiga i taunuuga tonu o le sela ma le metabolism o le faʻaletonu o le mitochondrial i neurons.
Ina ia malamalama i taunuuga o le metabolism o le faaletonu o le mitochondrial, na matou vavaeeseina ai Purkinje neurons (PNs) i vaega eseese o le neurodegeneration e mafua mai i le faaleagaina o le mitochondrial outer membrane fusion (Mfn2). E ui o le Mfn2 mutations i tagata e fesoʻotaʻi ma se ituaiga o hereditary motor sensory neuropathy e taʻua o le Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), o le faaleagaina o le Mfn2 i isumu o se metotia ua lauiloa o le induction of oxidation Phosphorylation (OXPHOS) dysfunction. O ituaiga eseese o neuronal (16-19) ma le neurodegenerative phenotype e mafua mai ai e o faatasi ma faailoga o le neurological progressive, e pei o le movement disorders (18, 19) po o le cerebellar ataxia (16). I le faaaogaina o se tuufaatasiga o label-free quantitative (LFQ) proteomics, metabolomics, imaging, ma virological methods, matou te faaalia ai o le progressive neurodegeneration e matua faatosina ai le pyruvate carboxylase (PCx) ma isi mea e aofia ai i le arteriosclerosis o PNs in vivo O le faailoaina o enzymes. Ina ia faʻamaonia le tāua o lenei sailiga, na matou faʻaitiitia faʻapitoa le faʻaalia o le PCx i le Mfn2-deficient PNs, ma maua ai o lenei taotoga na faʻateleina ai le atuatuvale o le oxidative ma faʻavavevaveina ai le neurodegeneration, ma faʻamaonia ai o le azoospermia e maua ai le oti o le sela. O le faʻaalia malosi o le MFN2 e mafai ona laveaʻiina atoatoa ai le terminal degeneration PN faʻatasi ai ma le ogaoga o le OXPHOS deficiency, le tele o le faʻaaogaina o le mitochondrial DNA, ma le foliga mai ua motusia le mitochondrial network, lea e faʻamamafa atili ai o lenei ituaiga o neurodegeneration e mafai ona toe faʻaleleia i le tulaga maualuga o le faʻamaʻi aʻo leʻi oti le sela.
Ina ia mafai ona vaʻaia le mitochondria i le Mfn2 knockout PNs, na matou faʻaaogaina se ituaiga isumu e mafai ai e le Cre-dependent mitochondria ona faʻatatau i le yellow fluorescent protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre expression ma siaki le mitochondrial morphology in vivo. Na matou iloa ai o le faʻaumatia o le Mfn2 gene i le PNs o le a taitai atu ai i le vaeluaina malie o le mitochondrial network (Ata S1A), ma o le suiga muamua na maua i le 3 vaiaso o le matua. I se faatusatusaga, o le faaleagaina tele o le PN cell layer, e pei ona molimauina e le leiloa o le Calbindin immunostaining, e leʻi amata seia oo i le 12 vaiaso o le matua (Ata 1, A ma le B). O le le fetaui o le taimi i le va o suiga muamua i le mitochondrial morphology ma le amataga vaaia o le oti o neuronal na uunaia ai i matou e suʻesuʻe suiga o le metabolism na mafua mai i le mitochondrial dysfunction aʻo leʻi oti le sela. Na matou atiaeina se fuafuaga fa'avae i luga o le fluorescence-activated cell sorting (FACS) e vavae'ese ai le YFP (YFP+)-expressing PN (Ata 1C), ma i isumu fa'atonutonu (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), o le a ta'ua i lalo o le CTRL (Ata S1B). O le fa'aleleia atili o le fuafuaga fa'apipi'i e fa'avae i luga o le malosi fa'atatau o le fa'ailo YFP e mafai ai ona matou fa'amamāina le tino YFP+ (YFPhigh) o PN mai non-PNs (YFPneg) (Ata S1B) po'o ni vaega fluorescent axon/dendritic putative (YFPlow; Ata S1D, agavale), fa'amaonia e le confocal microscope (Ata S1D, taumatau). Ina ia fa'amaonia le fa'asinomaga o le faitau aofa'i ua fa'avasegaina, na matou faia ai le LFQ proteomics ona sosoo ai lea ma le su'esu'ega o vaega autu, ma maua ai o lo'o i ai se vaeluaga manino i le va o sela YFPhigh ma YFPneg (Ata S1C). O sela o le YFPhigh na faʻaalia ai le faʻateleina o faʻailoga PN ua iloa (e pei o le Calb1, Pcp2, Grid2 ma le Itpr3) (21, 22), ae leai se faʻateleina o porotini e masani ona faʻaalia i totonu o neurons poʻo isi ituaiga sela (Ata 1D)). O se faʻatusatusaga i le va o faʻataʻitaʻiga i sela YFPhigh faʻavasegaina na aoina i faʻataʻitaʻiga tutoʻatasi na faʻaalia ai se coefficient correlation> 0.9, e faʻaalia ai le toe gaosia lelei i le va o replicates biological (Ata S1E). I se aotelega, o nei faʻamaumauga na faʻamaonia ai la matou fuafuaga mo le vavaeʻeseina faʻafuaseʻi ma faʻapitoa o le PN talafeagai. Talu ai o le faiga avetaavale L7-cre na faʻaaogaina e faʻaosofia ai le toe faʻafouina o le mosaic i le vaiaso muamua talu ona fanau (23), na amata ai ona matou faʻaumatia isumu mai le CTRL ma conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Aoina neurons. A maeʻa le toe faʻafouina, e taʻua o le Mfn2cKO i le 4 vaiaso o le matua. I le avea ai ma fa'ai'uga, na matou filifilia ai le 8 vaiaso o le matua ina ua atoatoa le vaega PN e ui lava i le manino o le vaeluaina o mitochondrial (Ata 1B ma le Ata S1A). I ​​le aotelega, na matou fuaina ai le aofa'i o porotini e 3013, e tusa ma le 22% na fa'avae i luga o fa'amatalaga a le MitoCarta 2.0 e fa'avae i luga o le mitochondrial proteome o le mitochondria (Ata 1E) (Ata 1E) (24). O le su'esu'ega o le fa'aalia o kenera eseese na faia i le vaiaso 8 na fa'aalia ai e na'o le 10.5% o porotini uma na i ai ni suiga taua (Ata 1F ma le Ata S1F), e 195 porotini na fa'aitiitia ma 120 porotini na fa'ateleina (Ata 1F). E taua le maitauina o le "su'esu'ega o auala fou" o lenei seti o fa'amaumauga e fa'aalia ai o kenera eseese o lo'o fa'aalia e masani lava ona i ai i se seti fa'atapula'aina o auala fa'apitoa o le metabolism (Ata 1G). O le mea e malie ai, e ui o le faʻaitiitia o auala e fesoʻotaʻi ma le OXPHOS ma le calcium signaling e faʻamaonia ai le faʻaosofiaga o le mitochondrial dysfunction i fusion-deficient PNs, o isi vaega e aofia ai le metabolism o amino acid e matua faʻateleina lava, lea e ogatusa ma le metabolism e tupu i mitochondrial PNs. Rewiring e tutusa lava.
(A) Ata fa'atusa o vaega o le cerebellar o isumu CTRL ma Mfn2cKO o lo'o fa'aalia ai le fa'asolosolo o le leiloa o PNs (calbindin, efuefu); o nuclei na fa'ailogaina i le DAPI. (B) Fuainumera o le (A) (su'esu'ega o le eseesega i le itu e tasi, ***P<0.001; n = 4 i le 6 li'o mai isumu e tolu). (C) Galuega fa'ata'ita'i. (D) Fa'asalalauga o le fa'afanua vevela o fa'ailoga e fa'apitoa i Purkinje (pito i luga) ma isi ituaiga sela (ogatotonu). (E) Ata Venn o lo'o fa'aalia ai le aofa'i o porotini mitochondrial ua fa'ailoaina i le PN fa'avasegaina. (F) Fa'afanua o le mauga mu o porotini eseese o lo'o fa'aalia i totonu o neurons Mfn2cKO i le 8 vaiaso (taua o le tipiina o le taua o le 1.3). (G) O le su'esu'ega o le auala fatufatua'i o lo'o fa'aalia ai auala e lima e sili ona taua i luga (mumu) ma lalo (lanumoana) i le Mfn2cKO PN ua fa'avasegaina o le 8 vaiaso. O lo'o fa'aalia le averesi o le tulaga o le fa'aalia o porotini ta'itasi ua iloa. Fa'afanua vevela efuefu: tau P ua fetu'una'i. ns, e le taua.
O faʻamaumauga o le proteomics na faʻaalia ai le faʻaitiitia malie o le faʻaalia o le porotini o le complexes I, III, ma le IV. O le Complexes I, III, ma le IV o loʻo i ai uma vaega taua o le mtDNA-encoded, ae o le complex II, lea na naʻo le nuclear-coded, e leʻi afaina tele (Ata 2A ma le Ata S2A). . E tusa ai ma taunuuga o le proteomics, o le immunohistochemistry o vaega o le cerebellar tissue na faʻaalia ai o le MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) subunit level o le complex IV i le PN na faʻaitiitia malie (Ata 2B). O le mtDNA-encoded subunit Mtatp8 na matua faʻaitiitia (Ata S2A), ae o le tulaga mautu o le nuclear-encoded ATP synthase subunit na tumau pea e leʻi suia, lea e ogatasi ma le stable ATP synthase subassembly F1 complex ua iloa pe a mautu le mtDNA expression. O le faʻavaeina e tutusa. Faʻalavelave (7). O le iloiloga o le tulaga mtDNA i totonu o le Mfn2cKO PNs ua fa'avasegaina e ala i le real-time polymerase chain reaction (qPCR) na fa'amaonia ai le fa'aitiitia malie o le numera o kopi o le mtDNA. Pe a fa'atusatusa i le vaega fa'atonutonu, i le 8 vaiaso o le matua, e na'o le tusa ma le 20% o le tulaga mtDNA na taofia (Ata 2C). E ogatusa ma nei taunuuga, o le valiina o le confocal microscopy o le Mfn2cKO PNs na fa'aaogaina e iloa ai le DNA, e fa'aalia ai le fa'aaogaina o nucleotides mitochondrial e fa'alagolago i le taimi (Ata 2D). Na matou iloa ai na'o nisi o sui tauva na a'afia i le fa'aleagaina o polotini mitochondrial ma le tali atu i le atuatuvale na fa'ateleina, e aofia ai le Lonp1, Afg3l2 ma le Clpx, ma OXPHOS complex assembly factors. E leai ni suiga taua i le tulaga o polotini e a'afia i le apoptosis na iloa (Ata S2B). I se tulaga tutusa, na matou iloa ai o mitochondria ma endoplasmic reticulum channels e a'afia i le felauaiga o le calcium e na'o ni suiga laiti (Ata S2C). E le gata i lea, o le iloiloga o polotini e fesoʻotaʻi ma le autophagy e leʻi maua ai ni suiga taua, lea e ogatasi ma le faʻaosofiaga vaaia o autophagosomes na matauina i totonu o le tino ola e ala i le immunohistochemistry ma le electron microscopy (Ata S3). Peitaʻi, o le faʻaletonu o le OXPHOS i PNs e o faʻatasi ma suiga manino o le mitochondrial ultrastructural. E mafai ona vaʻaia faʻaputuga Mitochondrial i totonu o tino o sela ma laʻau dendritic o Mfn2cKO PNs e 5 ma le 8 vaiaso le matutua, ma o le fausaga o le membrane i totonu ua i ai ni suiga tetele (Ata S4, A ma le B). E ogatasi ma nei suiga ultrastructural ma le faʻaitiitia tele o le mtDNA, o le suʻesuʻega o fasi cerebellar cerebral acute ma le tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) na faʻaalia ai o le mitochondrial membrane potential i Mfn2cKO PNs na faʻaitiitia tele (Ata S4C).
(A) Su'esu'ega o le taimi o le tulaga fa'aalia o le OXPHOS complex. Mafaufau i na'o porotini ma le P<0.05 i le 8 vaiaso (two-way ANOVA). Laina togitogi: Leai se fetu'una'iga pe a fa'atusatusa i le CTRL. (B) Agavale: O se fa'ata'ita'iga o se vaega o le cerebellar ua fa'ailogaina i le anti-MTCO1 antibody (scale bar, 20 μm). O le vaega o lo'o nofoia e Purkinje cell bodies ua ufiufiina i le samasama. Taumatau: Fuainumera o le MTCO1 (su'esu'ega o le eseesega i le tasi itu; n = 7 i le 20 sela na su'esu'eina mai isumu e tolu). (C) Su'esu'ega qPCR o le numera kopi mtDNA i le PN ua fa'avasegaina (su'esu'ega o le eseesega i le tasi itu; n = 3 i le 7 isumu). (D) Agavale: O se fa'ata'ita'iga o se fasi cerebellar ua fa'ailogaina i se anti-DNA antibody (scale bar, 20 μm). O le vaega o lo'o nofoia e Purkinje cell bodies ua ufiufiina i le samasama. Taumatau: Fuainumera o mtDNA lesions (su'esu'ega o le eseesega i le tasi itu; n = 5 i le 9 sela mai isumu e tolu). (E) O se faʻataʻitaʻiga o se vaega faʻafuaseʻi o le cerebellar o loʻo faʻaalia ai sela mitoYFP + Purkinje (aū) i totonu o se faʻamaumauga o le patch clamp atoa-sela. (F) Faʻatusatusaga o le IV curve. (G) Faʻamaumauga faʻatusa o le tuiina o le eletise depolarizing i sela CTRL ma Mfn2cKO Purkinje. Faʻailoga pito i luga: O le pulse muamua na faʻaosofia ai le AP. Faʻailoga pito i lalo: Taimi maualuga o le AP. (H) Faʻatusatusaga o faʻamatalaga faʻafuaseʻi postsynaptic (sPSPs). O le faʻailoga faʻatusa o le faʻamaumauga ma lona fua faʻatatau o le zoom o loʻo faʻaalia i le (I). O le suʻesuʻega tasi-ala o le eseesega na auʻiliʻiliina n = 5 i le 20 sela mai isumu e tolu. O faʻamatalaga o loʻo faʻaalia o le averesi ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Faʻailoga faʻatusa o le AP faʻafuaseʻi na faʻamaumauina e faʻaaoga ai le faiga o le perforated patch clamp. Faʻailoga pito i luga: Taimi maualuga o le AP. Faʻailoga pito i lalo: faʻateleina o se AP e tasi. (K) Faʻatusatusa le averesi ma le taimi maualuga o le AP e tusa ai ma le (J). Suʻega Mann-Whitney; n = 5 sela na auʻiliʻiliina mai isumu e fa. O faʻamatalaga o loʻo faʻaalia o le averesi ± SEM; e le taua.
Sa iloa le faaleagaina manino o le OXPHOS i le Mfn2cKO PN e 8 vaiaso le matua, o lona uiga o le galuega faaletino o neurons e matua le masani ai. O le mea lea, na matou iloiloina ai uiga eletise le gaoioi o neurons e le lava le OXPHOS i le 4 i le 5 vaiaso ma le 7 i le 8 vaiaso e ala i le faia o faamaumauga o le whole-cell patch clamp i fasi cerebellar acute (Ata 2E). E le’i mafaufauina, o le averesi o le resting membrane potential ma le input resistance o le Mfn2cKO neurons sa tutusa ma le pulega, e ui lava sa i ai ni eseesega laiti i le va o sela (Table 1). I se tulaga tutusa, i le 4 i le 5 vaiaso o le matua, e leai ni suiga taua i le sootaga o le current-voltage (IV curve) na maua (Ata 2F). Peitai, e leai ni neurons Mfn2cKO e 7 i le 8 vaiaso le matua na sao mai le IV regimen (hyperpolarization step), o lona uiga o loo i ai se lagona manino i le hyperpolarization potential i lenei laasaga mulimuli. I se faatusatusaga, i totonu o neura Mfn2cKO, o tafega depolarizing e mafua ai ona toe faʻaauau pea le gaioiga o le gafatia (AP) e taliaina lelei, e faʻaalia ai o latou mamanu faʻasaʻoloto lautele e le o se eseesega tele mai i latou o neura pulea e 8-vaiaso le matutua (Table 1 ma le Ata 2G). I se tulaga tutusa, o le tele ma le malosi o tafega postsynaptic faafuasei (sPSCs) e tutusa ma i latou o le vaega pulea, ma o le tele o mea na tutupu na faateleina mai le 4 vaiaso i le 5 vaiaso i le 7 vaiaso i le 8 vaiaso faatasi ai ma se faʻaopoopoga tutusa (Ata 2, H ma le I). O le vaitaimi o le synaptic maturation i PNs (25). O taunuuga tutusa na maua ina ua maeʻa ni patches PNs ua pu. O lenei faʻatulagaga e taofia ai le ono mafai ona toe faʻaleleia o faʻaletonu o le ATP o le sela, e pei ona ono tupu i le faʻamaumauga o le whole-cell patch clamp. Ae maise lava, o le resting membrane potential ma le spontaneous firing frequency o neura Mfn2cKO e leʻi afaina (Ata 2, J ma le K). I se aotelega, o nei taunuuga e faʻaalia ai o PN e manino lava le faʻaletonu o le OXPHOS e mafai ona taulimaina lelei mamanu o le faʻasaʻolotoina o le tele o taimi, e faʻaalia ai o loʻo i ai se auala e taui ai e mafai ai ona latou faatumauina tali masani o le electrophysiological.
O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o le averesi ± SEM (su'esu'ega o le eseesega i le itu e tasi, suega fa'atusatusaga tele a Holm-Sidak; *P<0.05). O le numera o le iunite o lo'o fa'ailoa mai i totonu o fa'ailoga puipui.
Na matou fa'atulaga e su'esu'e pe o iai se vaega i le fa'amaumauga o le proteomics (Ata 1G) e aofia ai auala e mafai ona tete'e atu ai i le le lava o le OXPHOS, ma fa'amatalaina ai le mafua'aga e mafai ai e le PN ua a'afia ona fa'atumauina le electrophysiology e toetoe lava a masani (Ata 2, E i le K). . Na fa'aalia e le au'ili'iliga o le proteomics o enzymes o lo'o a'afia i le catabolism o branched chain amino acids (BCAA) na matua'i fa'ateleina (Ata 3A ma le Ata S5A), ma o le oloa mulimuli o le acetyl-CoA (CoA) po'o le succinyl CoA e mafai ona fa'aopoopo i le tricarboxylates i le arteriosclerosis Acid (TCA) cycle. Na matou iloa ai o le aofa'i o le BCAA transaminase 1 (BCAT1) ma le BCAT2 e fa'ateleina uma. Latou te fa'atinoina le la'asaga muamua o le BCAA catabolism e ala i le gaosia o le glutamate mai le α-ketoglutarate (26). O vaega uma e fausia ai le branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) complex ua fa'ateleina (o le complex e fa'atino ai le decarboxylation mulimuli ane ma le toe mafai ona toe fa'afo'isia o le BCAA carbon skeleton) (Ata 3A ma le Ata S5A). Peita'i, e leai ni suiga manino i le BCAA lava ia na maua i le PN ua fa'avasegaina, lea atonu e mafua mai i le fa'ateleina o le fa'aaogaina e sela o nei amino acids taua po'o le fa'aaogaina o isi punaoa (glucose po'o le lactic acid) e fa'aopoopo i le ta'amilosaga TCA (Ata S5B). O PN e leai ni OXPHOS na fa'aalia ai fo'i le fa'ateleina o le glutamine decomposition ma le transamination activities i le 8 vaiaso o le matua, lea e mafai ona atagia mai e le fa'ateleina o le mitochondrial enzymes glutaminase (GLS) ma le glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Ata 3, A ma le C). E tāua le mātauina o le fa’ateleina o le GLS e fa’atapula’aina i le spliced ​​​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (o le suiga o le Mfn2cKO/CTRL e tusa ma le 4.5-fold, P = 0.05), ma o lona fa’ateleina fa’apitoa i totonu o a’ano o le kanesa e mafai ona lagolagoina le mitochondrial bioenergy. (27).
(A) O le fa'afanua vevela o lo'o fa'aalia ai le suiga o le gaugau i le tulaga o le porotini mo le auala fa'apitoa i le 8 vaiaso. (B) Fa'ata'ita'iga o se fasi cerebellar ua fa'ailogaina i le anti-PCx antibody (scale bar, 20 μm). O le aū samasama e fa'asino i le tino o le sela Purkinje. (C) Su'esu'ega o le fa'aalia o le porotini i le taimi ua fa'ailoa mai o se sui taua mo le atherosclerosis (tele t-test, *FDR <5%; n = 3-5 isumu). (D) I luga: O se ata fa'ata'ita'i o lo'o fa'aalia ai auala eseese e ulufale ai i le kaponi ua fa'ailogaina o lo'o i totonu o le [1-13C]pyruvate tracer (e pei o le PDH po'o le auala trans-arterial). I lalo: O le siata vaiolini o lo'o fa'aalia ai le pasene o le kaponi e tasi le fa'ailogaina (M1) ua liua i le aspartic acid, citric acid ma le malic acid pe a uma ona fa'ailogaina fasi cerebellar fa'apitoa i le [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01). (E) Su'esu'ega atoa o le tala'aga o le taimi o le auala ua fa'ailoa mai. Mafaufau i porotini ma le P<0.05 i le 8 vaiaso. Laina motumotu: leai se tau fetu'una'iga (su'esu'ega lua-itu o le fesuia'iga; * P <0.05; *** P <0.001). O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o le averesi±SEM.
I la matou suʻesuʻega, ua avea le BCAA catabolism ma se tasi o auala autū e faʻaleleia atili ai le faʻaleleia o le tino. O lenei mea moni e faʻaalia ai o le tele o le ea e ulufale atu i le taʻamilosaga TCA e ono suia i le PN e leai se OXPHOS. Atonu o se ituaiga tele lea o le toe faʻaleleia o le metabolism o neurons, lea e ono i ai se aafiaga tuusaʻo i le physiology neuronal ma le ola i le taimi o le faʻaauauina o le faʻaletonu ogaoga o le OXPHOS. E ogatasi ma lenei manatu, na matou maua ai o le enzyme autu e teteʻe i le atherosclerotic PCx ua faʻaleleia atili (Mfn2cKO/CTRL e suia pe tusa ma le 1.5 taimi; Ata 3A), lea e faʻamalosia ai le liua o le pyruvate i le oxaloacetate (28), lea e talitonuina o loʻo i totonu o le aʻano o le faiʻai. O le faʻaalia i totonu e faʻatapulaʻaina i astrocytes (29, 30). E ogatasi ma taunuuga o le proteomics, o le confocal microscopy na faʻaalia ai o le faʻaalia o le PCx sa faʻapitoa ma faʻateleina tele i le OXPHOS-deficient PNs, ae o le tali atu o le PCx sa faʻatapulaʻaina tele i sela glial Bergmann o loʻo i tafatafa o le pulea (Ata 3B). Ina ia fa'ata'ita'i lelei le fa'ateleina o le PCx na matauina, na matou togafitia ai fasi cerebellar fa'afuase'i i le [1-13C]pyruvate tracer. Ina ua fa'a'oksizenina le pyruvate e le pyruvate dehydrogenase (PDH), na mou atu lona fa'ailoga isotope , Ae ua tu'ufa'atasia i totonu o vaega o le ta'amilosaga TCA pe a fa'ametabolize le pyruvate e ala i tali atu i ala toto (Ata 3D). I le lagolagoina o a matou fa'amaumauga proteomics, na matou matauina ai le tele o fa'ailoga mai lenei tracer i le aspartic acid o fasi Mfn2cKO, ae o le citric acid ma le malic acid sa i ai fo'i se aga masani, e ui lava e le taua (Ata 3D).
I totonu o neura dopamine o isumu MitoPark e iai le faaletonu o le mitochondrial e mafua mai i neura dopamine e faaleagaina faapitoa le mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) (Ata S6B), o le faʻaalia o le PCx sa faʻateleina foi (31), e faʻaalia ai o le acetone acid arteriosclerosis O le tupu mai o le faʻamaʻi e faʻatonutonuina i le taimi o le faaletonu o le neuronal OXPHOS i le tino. E taua le maitauina ua maua o enzymes tulaga ese (32-34) e ono faʻaalia i neura e ono fesoʻotaʻi ma le arteriosclerosis e faʻateleina tele i PN e leai ni OXPHOS, e pei o le propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA e liua le propionyl-CoA i le succinyl-CoA ma le mitochondrial malic enzyme 3 (ME3), o lona matafaioi autu o le toe faʻaleleia o le pyruvate mai le malate (Ata 3, A ma le C) (33, 35). E le gata i lea, na matou maua ai se fa’aopoopoga tele i le enzyme Pdk3, lea e fa’aphosphorylate ma fa’agata ai le PDH (36), ae leai ni suiga na iloa i le enzyme Pdp1 lea e fa’agaoioia ai le PDH po’o le PDH enzyme complex lava ia (Ata 3A). E tutusa lava, i Mern2cKO PNs, o le phosphorylation o le α1 subunit α (PDHE1α) subunit o le pyruvate dehydrogenase E1 component o le PDH complex i le Ser293 (ua iloa e taofia ai le enzyme activity o le PDH) na fa’aleleia atili (Ata S6C) (Ata S6C). E leai se avanoa e maua i le vascular e le Pyruvate.
I le iuga, na matou iloa ai o le auala sili o le serine ma le glycine biosynthesis, le mitochondrial folate cycle (1C) ma le proline biosynthesis (Ata 1G ma le Ata S5C) ua matuā fa’ateleina uma, e tusa ai ma lipoti, i le taimi o le fa’agasologa o le fa’agaoioiga. O a’ano o lo’o siomia ai ua fa’agaoioia ma le mitochondrial dysfunction (5-7). O le au’ili’iliga fa’alilolilo e lagolagoina nei fa’amaumauga o le proteomics na fa’aalia ai i le PN ma le leai o le OXPHOS, o fasi cerebellar o isumu e 8-vaiaso le matutua na faia i ai le serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), o se enzyme autu o le mitochondrial folate cycle. Tali taua o le puipuiga o le tino (Ata S5D). I le 13 CU-glucose-incubated acute cerebellar slices, o fa’ata’ita’iga o le metabolic tracing na fa’amaonia atili ai le fa’ateleina o le serine ma le proline biosynthesis, ma fa’ailoa mai ai o le tafega o carbon isoforms i totonu o le serine ma le proline ua fa’ateleina (Ata S5E). Talu ai o tali e faʻalauiloa e le GLS ma le GPT2 e nafa ma le faʻaputuga o le glutamate mai le glutamine ma le transamination i le va o le glutamate ma le α-ketoglutarate, o lo latou faʻateleina o loʻo faʻaalia ai o neura e le lava le OXPHOS e iai le manaʻoga faʻateleina mo le glutamate, Atonu e faʻatatau lenei mea i le faʻatumauina o le faʻateleina o le biosynthesis o le proline (Ata S5C). I le faʻatusatusa i nei suiga, o se suʻesuʻega proteomic o cerebellar astrocytes mai isumu PN-specific Mfn2cKO na faʻaalia ai o nei auala (e aofia ai antiperoxidases uma) e leʻi suia tele i le faʻaalia, ma faʻaalia ai lenei metabolic redirection e filifilia i le PN ua faʻaleagaina (Ata S6, D i le G).
I se aotelega, o nei suʻesuʻega na faʻaalia ai ni mamanu eseese o le faʻagaoioiga faʻavaitaimi o auala faʻapitoa o le metabolism i PNs. E ui o le galuega le masani a le neuronal mitochondrial e mafai ona oʻo atu ai i le vave atherosclerosis ma le 1C remodeling (Ata 3E ma le Ata S5C), ma e oʻo lava i suiga e mafai ona vaʻaia i le faʻaalia o I ma IV complexes, o suiga i le serine de novo synthesis e naʻo le OXPHOS dysfunction (Ata 3E ma le Ata S5C). O nei faʻamaumauga e faʻamatalaina ai se faʻagasologa faʻasolosolo lea e tali atu ai le mitochondrial (1C cycle) ma le cytoplasmic (serine biosynthesis) i le faʻateleina o le atherosclerosis i le TCA cycle e toe faʻatulaga ai le neuronal metabolism.
E mafai e PN e 8 vaiaso le matutua ona faʻatumauina le gaioiga faʻaosofia maualuga ma toe faʻafesoʻotaʻi le metabolism e faʻafetaui ai le faʻaletonu o le mitochondrial. O lenei sailiga e faʻaalia ai se avanoa manaia e oʻo lava i le taimi nei, e mafai foʻi e nei sela ona maua se togafitiga faʻafomaʻi e faʻatuai ai pe puipuia ai le neurodegeneration. Tuai. Na matou foia lenei avanoa e ala i ni togafitiga tutoʻatasi se lua. I le metotia muamua, na matou mamanuina ai se Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector ina ia mafai ona faʻaalia ma le filifilia le MFN2 i OXPHOS-deficient PNs in vivo (Ata S7A). O le AAV o loʻo faʻailoa mai ai le MFN2 ma le fluorescent reporter gene mCherry (Mfn2-AAV) na faʻamaonia i totonu o aganuʻu muamua o neuron i vitro, lea na mafua ai ona faʻaalia le MFN2 i se auala e faʻalagolago i le Cre ma laveaʻiina ai le morphology mitochondrial, ma puipuia ai le neuromutation i Mfn2cKO neurons (Ata S7, B, D ma le E). Sosoo ai, na matou faia ni faʻataʻitaʻiga i totonu o le tino e tuʻuina atu ai le Mfn2-AAV e 8 vaiaso le matua i le cerebellar cortex o le Mfn2cKO ma isumu pulea, ma suʻesuʻeina isumu e 12 vaiaso le matutua (Ata 4A). O isumu Mfn2cKO na togafitia na feoti (Ata 1, A ma le B) (16). O le faʻaliliuina o siama i totonu o le tino na mafua ai ona faʻaalia faʻapitoa le PN i nisi o liʻo o le cerebellar (Ata S7, G ma le H). O le tuiina o le AAV pulea e naʻo le faʻaalia o le mCherry (Ctrl-AAV) e leai se aafiaga taua i le tulaga o le neurodegeneration i manu Mfn2cKO. I se faʻatusatusaga, o le suʻesuʻega o Mfn2cKOs na faʻaliliuina i le Mfn2-AAV na faʻaalia ai se aafiaga taua o le puipuiga o le vaega o le sela PN (Ata 4, B ma le C). Ae maise lava, o le mafiafia o neuron e foliga mai e toetoe lava a le mafai ona iloa mai manu pulea (Ata 4, B ma le C, ma Ata S7, H ma le I). O le fa'aalia o le MFN1 ae le o le MFN2 e tutusa lava le aoga i le fa'asaoina o le oti o neula (Ata 4C ma le Ata S7, C ma le F), lea e fa'ailoa mai ai o le fa'aalia o le ectopic MFN1 e mafai ona fa'aopoopoina lelei le leai o le MFN2. O su'esu'ega fa'aopoopo i le tulaga PN e tasi na fa'aalia ai o le Mfn2-AAV na fa'asaoina tele ai le ultrastructure o mitochondria, fa'atulagaina le maualuga o le mtDNA, ma fa'aliliuina le maualuga o le fa'aalia o le anti-angiogenesis marker PCx ​​​​(Ata 4, C i le E). O le su'esu'ega va'aia o isumu Mfn2cKO na lavea'iina i se tulaga malolo na fa'aalia ai o latou tulaga ma fa'ailoga o le gaioiga (gaioiga S1 i le S3) na fa'aleleia. I le fa'ai'uga, o nei fa'ata'ita'iga e fa'aalia ai o le toe fa'atopetope o le toe fa'aofiina o le MFN2 i totonu o PNs e matua'i le lava i le OXPHOS e lava lea e fa'aliliu ai le fa'aaogaina o le mtDNA ma fa'aosofia ai le atherosclerosis, ma puipuia ai le fa'aleagaina o le axon ma le oti o neula i totonu o le tino.
(A) O se fuafuaga e faʻaalia ai le faʻasologa o faʻataʻitaʻiga mo le tuiina o le AAV e faʻailoa ai le MFN2 pe a faʻagaoioia le auala metabolic ua faʻailoa mai. (B) Ata faʻatusa o le cerebellar slices e 12-vaiaso le matutua na faʻaliliuina i le 8 vaiaso i isumu Mfn2cKO ma faʻailogaina i le anti-Calbindin antibody. Taumatau: Scaling o alava axon. O le fua o le axon zoom e 450 ma le 75 μm. (C) Agavale: Fuainumera o le Purkinje cell density i le AAV transduction loop (AAV+) (tasi le itu auiliga o le eseesega; n = 3 isumu). Taumatau: mtDNA focus analysis i le transduced PN i le vaiaso 12 (unpaired t-test; n = 6 sela mai isumu e tolu). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Faʻatusa o le transmission electron micrographs o PNs o Mfn2cKO cerebellar sections na faʻaliliuina ma viral vectors ua faʻailoa mai. O le ufimata piniki e faʻaalia ai le vaega o loʻo nofoia e dendrites, ma o le sikuea togitogi samasama e faʻaalia ai le zoom o loʻo tuʻuina atu i le taumatau; n e faʻatusalia ai le nucleus. O le pa fua, 1μm. (E) o loʻo faʻaalia ai se faʻataʻitaʻiga o le valiina o le PCx i le PN na faʻaliliuina i le 12 vaiaso. Pa fua, 20μm. OE, soʻona faʻaalia; FC, suiga o le gaugau.
I le iuga, na matou suʻesuʻeina le taua o le ola o sela e mafua mai i le peroxidase i PN ua oʻo i le faʻaletonu o le OXPHOS. Na matou gaosia le mCherry e faʻailoa ai le AAV-shRNA (short hairpin RNA) e faʻatatau tonu i le PCx mRNA o isumu (AAV-shPCx), ma tuiina le siama poʻo lana scrambled control (AAV-scr) i totonu o le cerebellum o isumu Mfn2cKO. Na faia le tui i le vaiaso lona fa o le matua (Ata 5A) ina ia ausia ai le PCx knockdown lelei i le taimi na faʻateleina ai le faʻaalia o le PCx (Ata 3C) ma o loʻo tumau pea le vaega o le PN cell (Ata 1A). E taua le maitauina o le tuʻuina ifo o le PCx (Ata S8A) e oʻo atu ai i le faʻavavevaveina tele o le oti o le PN, lea e faʻatapulaʻaina i le mama ua aʻafia (Ata 5, B ma le C). Ina ia malamalama i le faiga o aafiaga metabolic na mafua mai i le PCx up-regulation, na matou suʻesuʻeina le tulaga redox o PNs ina ua maeʻa ona faʻaalia faʻatasi le PCx knockdown ma le AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 (Ata S8, B i le D) e iloilo ai le glutathione O le suiga faʻatatau o le peptide redox potential (38). Ona matou faia lea o le two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) i fasi faiʻai ogaoga o le Mfn2cKO e 7 vaiaso le matua poʻo le control littermates e iloa ai suiga e ono tulaʻi mai i le cytoplasmic redox status ina ua maeʻa ona faʻamaonia tulaga FLIM (Ata S8, E i le G). Na faʻaalia e le auʻiliʻiliga se faʻaopoopoga tele i le oxidation state o se Mfn2cKO PNs e tasi e leai se PCx expression, lea e ese mai i control neurons poʻo Mfn2cKO PNs e naʻo le scrambled shRNA e faʻaalia (Ata 5, D ma le E). Ina ua fa'aitiitia le fa'aalia o le PCx, o le pasene o le Mfn2cKO PNs o lo'o fa'aalia ai se tulaga ua matua'i fa'aoksitenaina na fa'ateleina i le silia ma le fa'atolu (Ata 5E), e fa'ailoa mai ai o le fa'ateleina o le PCx na fa'atumauina ai le gafatia redox o neurons ua fa'aleagaina.
(A) O se fuafuaga e faʻaalia ai le faʻasologa o faʻataʻitaʻiga mo le tuiina o le AAV e faʻailoa ai le shPCx pe a faʻagaoioia le auala metabolic ua faʻailoa mai. (B) Ata faʻatusa o vaega o le cerebellar e 8-vaiaso le matutua i isumu Mfn2cKO ua faʻaliliuina ma faʻailogaina i le anti-calcineurin antibody i le 4 vaiaso. Pa fua, 450μm. (C) Fuainumera o le tele o sela Purkinje i totonu o AAV-transduced loops (suʻesuʻega o le eseesega i le itu e tasi; n = 3 i le 4 isumu). O faʻamatalaga o loʻo faʻaalia o le averesi ± SEM; ***P<0.001. (D) Ata faʻatusa o le FLIM o loʻo faʻaalia ai le averesi o le umi o le olaga o le PN e 7-vaiaso le matutua o loʻo faʻaalia le glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 i lalo o tulaga faʻataʻitaʻi ua faʻamaotiina. LUT (laulau vaʻai) fua faatatau: taimi ola (i picoseconds). Pa fua, 25μm. (E) O le histogram o loʻo faʻaalia ai le tufatufaina o tau o le olaga atoa o le Grx1-roGFP2 mai le (D) (n=158 i le 368 sela i isumu e lua i lalo o tulaga taʻitasi). O le siata pai i luga aʻe o histogram taʻitasi: o loʻo faʻaalia ai le aofaʻi o sela e umi atu (mumu, faʻamaʻi) pe puʻupuʻu (lanumoana, faʻaitiitia) tau o le olaga, lea e sili atu i le 1 SD o le averesi o le tau o le olaga i le CTRL-AAV-scr. (F) O le faʻataʻitaʻiga ua fautuaina o loʻo faʻaalia ai le aʻafiaga puipuia o le faʻateleina o le neuronal PCx.
I le aotelega, o faʻamaumauga matou te tuʻuina atu iinei e faʻaalia ai o le toe faʻaalia o le MFN2 e mafai ona laveaʻiina atoatoa le PN ua leva ona i ai le le lava o le OXPHOS, le faʻaitiitia tele o le mtDNA, ma le foliga e pei o le ista e matua le masani ai, ma o lea e maua ai le alualu i luma faifai pea e oʻo lava i faʻamaʻi ua leva. O le neurodegeneration e maua ai faʻamaoniga e mafai ona toe faʻafoʻisia o le tulaga aʻo leʻi oti le sela. O lenei tikeri o le fetuutuunai o le metabolism e faʻamamafa atili e le mafai e neurons ona faʻaosofia le atherosclerosis (o se toe faʻafouina o le taʻamilosaga TCA), lea e taofia ai le faʻaalia o le PCx i PN e leai se OXPHOS ma faʻaleleia atili ai le oti o le sela, ma faia ai se matafaioi puipuia (Ata 5F).
I lenei suʻesuʻega, na matou tuʻuina atu ai faʻamaoniga o le tali atu o PNs i le faʻaletonu o le OXPHOS o le faasolosolo malie lea ona oʻo atu i le TCA cycle atherosclerosis e ala i le auala faʻagaoioia eseese e faʻagaoioia e polokalame metabolic. Na matou faʻamaonia le auʻiliʻiliga proteomic i le tele o metotia faʻaopoopo ma faʻaalia ai pe a luʻitauina e le faʻaletonu ogaoga o le mitochondrial, o neurons e iai se ituaiga e leʻi iloa muamua o le metabolic elasticity. O le mea e ofo ai, o le faagasologa atoa o le toe faʻafouina e le o faʻailogaina ai le tulaga faʻaiʻu o le metabolic lea e o faʻatasi ma le neurodegeneration faasolosolo malie ma le le toe suia, ae o a matou faʻamaumauga e fautua mai ai atonu o se neuron tausiga e oʻo lava i le tulaga aʻo leʻi oti le sela Functional compensation mechanism. O lenei sailiga e faʻaalia ai o neurons e iai se tikeri tele o le metabolic plasticity i le tino. O lenei mea moni e faʻamaonia ai o le toe faʻaofiina mulimuli ane o le MFN2 e mafai ona suia le faʻaalia o faʻailoga autu o le metabolic ma puipuia ai le PN degeneration. I se isi itu, e taofia ai le atherosclerosis ma faʻavavevaveina ai neula. transsexual.
O se tasi o mea e sili ona mata'ina i la matou su'esu'ega, o PN e leai ni OXPHOS e mafai ona suia le metabolism o le TCA cycle e ala i le fa'ateleina o enzymes e fa'aosofia ai le arteriosclerosis. O le toe fa'atulagaina o le metabolism o se mea masani lea e tupu i sela o le kanesa, o nisi o ia mea e fa'alagolago i le glutamine e fa'aopoopo i le TCA cycle intermediates e gaosia ai mea e fa'aitiitia ai le tutusa, lea e fa'agaoioia ai le respiratory chain ma fa'atumauina le gaosiga o lipid ma nucleotide biosynthesis precursors (39, 40). O se su'esu'ega talu ai nei na fa'aalia ai i totonu o a'ano o lo'o a'afia i le le lelei o le OXPHOS, o le toe fa'afeso'ota'iina o le glutamine/glutamate metabolism o se mea taua foi (5, 41), lea e fa'alagolago ai le itu e ulufale ai le glutamine i le TCA cycle Ona o le ogaoga o le manu'a o le OXPHOS (41). ). Peita'i, e leai ni fa'amaoniga manino i so'o se tutusa o le neuronal metabolic plasticity i le tino ma lona talafeagai i le tulaga o le fa'ama'i. I se su'esu'ega talu ai nei i vitro, na fa'aalia ai o neurons cortical muamua e fa'agaoioia ai vaituloto glutamate mo le neurotransmission, ma fa'alauiloa ai le oxidative metabolism ma le atherosclerosis i lalo o tulaga o le metabolic stress (42). E tāua le mātauina o loʻo i lalo o le faʻalavelave faʻafomaʻi o le TCA cycle enzyme succinate dehydrogenase, e talitonuina o le pyruvate carboxylation e faʻatumauina ai le faʻaputuga o le oxaloacetate i totonu o le cerebellar granule neurons ua faʻatupuina (34). Peitaʻi, o le taua faʻaletino o nei faiga i le aano o le faiʻai (lea e talitonuina o le atherosclerosis e naʻo astrocytes) e iai pea le taua faʻaletino taua (43). I lenei tulaga, o a matou faʻamaumauga e faʻaalia ai o PNs ua faʻaleagaina e le OXPHOS i le tino e mafai ona sui i le faʻaleagaina o le BCAA ma le pyruvate carboxylation, o puna autu ia e lua o le faʻaopoopoina o TCA pool intermediates. E ui lava ua fautuaina le sao o le BCAA catabolism i le neuronal energy metabolism, e faʻaopoopo i le matafaioi a le glutamate ma le GABA mo le neurotransmission (44), e leai lava se faʻamaoniga mo nei faiga i totonu o le tino. O le mea lea, e faigofie ona mateina e mafai e PNs le lelei ona faʻatupe otometi mo le faʻaaogaina o TCA intermediates e mafua mai i le faʻagasologa o le faʻafefiloi e ala i le faʻateleina o le atherosclerosis. Aemaise lava, o le fa'ateleina o le PCx atonu e mana'omia e fa'atumauina ai le fa'ateleina o le mana'oga mo le aspartic acid, lea e fautuaina i sela o lo'o fa'ateleina ma le fa'aletonu o le mitochondrial (45). Peita'i, o la matou su'esu'ega o le metabolomics e le'i fa'aalia ai ni suiga taua i le tulaga mautu o le aspartic acid i le Mfn2cKO PNs (Ata S6A), lea e foliga mai o lo'o atagia mai ai le eseesega o le fa'aaogaina o le aspartic acid i le va o sela o lo'o fa'ateleina ma neurons post-mitotic. E ui lava o le faiga tonu o le fa'ateleina o le PCx i neurons e le lelei i totonu o le tino e le'i fa'atinoina i totonu o le tino e le'i fa'atinoina i totonu o le tino, ae na matou fa'aalia o lenei tali vave e taua tele i le fa'atumauina o le tulaga redox o neurons, lea na fa'aalia i fa'ata'ita'iga FLIM i luga o fasi cerebellar. Aemaise lava, o le taofia o PNs mai le fa'ateleina o le PCx e mafai ona o'o atu ai i se tulaga sili atu ona oxidized ma fa'avavevave ai le oti o le sela. O le fa'agaoioia o le fa'aleagaina o le BCAA ma le carboxylation o le pyruvate e le o ni auala e fa'ailoa ai a'ano o le mitochondrial dysfunction (7). O le mea lea, e foliga mai o se mea e fa'amuamua i neurons e le lava le OXPHOS, e tusa lava pe le na'o le pau lea o le mea, lea e taua mo le neurodegeneration. .
O le faʻamaʻi o le cerebellar o se ituaiga eseese o faʻamaʻi neurodegenerative e masani ona faʻaalia o le ataxia ma e masani ona faʻaleagaina ai PNs (46). O lenei vaega o neuron e matua vaivai lava i le mitochondrial dysfunction ona o lo latou degeneration filifilia i isumu e lava lea e toe gaosia ai le tele o faʻailoga o le gaioiga e faʻailoa ai le spinocerebellar ataxia o le tagata (16, 47, 48). E tusa ai ma lipoti, o se faʻataʻitaʻiga isumu transgenic ma se gene mutant e fesoʻotaʻi ma le spinocerebellar ataxia o le tagata ma e iai le mitochondrial dysfunction (49, 50), ma faʻamamafa ai le taua o le suʻesuʻeina o taunuuga o le le lava o le OXPHOS i le PNPH. O le mea lea, e matua talafeagai lava le vavaeʻeseina ma le suʻesuʻeina lelei o lenei vaega tulaga ese o neuron. Peitaʻi, ona o PNs e matua maaleale lava i le mamafa ma e aofia ai se vaega maualalo o le vaega atoa o le sela cerebellar, mo le tele o suʻesuʻega e faʻavae i luga o le omics, o le vavaeʻeseina filifilia o latou o ni sela atoa o se itu faigata pea. E ui lava e toetoe lava a le mafai ona ausia le leai atoatoa o le faʻaleagaina o isi ituaiga sela (aemaise lava aano o tagata matutua), na matou tuʻufaʻatasia se laʻasaga lelei o le faʻamavaeina ma le FACS e maua ai se aofaʻi lava o neurons ola mo le suʻesuʻega o le proteomics i lalo, ma e maualuga tele le ufiufi o porotini (pe tusa ma le 3000 porotini) pe a faʻatusatusa i le seti o faʻamaumauga o loʻo iai nei o le cerebellum atoa (51). I le faʻasaoina o le ola o sela atoa, o le metotia matou te tuʻuina atu iinei e le gata ina mafai ai ona matou siakiina suiga i auala metabolic i le mitochondria, ae faʻapea foʻi ona siakiina suiga i ona cytoplasmic counterparts, lea e faʻaopoopoina ai le faʻaaogaina o mitochondrial membrane tags e faʻamauoa ai le ituaiga sela. O le metotia fou mo le aofaʻi o mitochondria i aano faigata (52, 53). O le metotia matou te faʻamatalaina e le gata e fesoʻotaʻi ma le suʻesuʻeina o sela Purkinje, ae mafai ona faʻaaogaina faigofie i soʻo se ituaiga sela e faʻatalanoaina ai suiga metabolic i faiʻai mamaʻi, e aofia ai isi faʻataʻitaʻiga o le faʻaletonu o le mitochondrial.
Ma le mea mulimuli, ua matou faʻailoaina se faʻamalama faʻamalolo i le taimi o lenei faʻagasologa o le toe faʻatulagaina o le metabolism e mafai ona suia atoa ai faʻailoga autu o le atuatuvale o le sela ma puipuia ai le faʻaleagaina o neula. O le mea lea, o le malamalama i aafiaga faʻatino o le toe faʻapipiʻiina o fesoʻotaʻiga o loʻo faʻamatalaina iinei e mafai ona maua ai ni malamalamaga taua i togafitiga e ono mafai ona faʻatumauina ai le ola o neula i le taimi o le faʻaletonu o le mitochondrial. O suʻesuʻega i le lumanaʻi e faʻatatau i le suʻesuʻeina o suiga i le metabolism o le malosi i isi ituaiga o sela o le faiʻai e manaʻomia e faʻaalia atoatoa ai le faʻaaogaina o lenei mataupu faavae i isi faʻamaʻi neula.
Ua uma ona faʻamatalaina muamua isumu MitoPark (31). O isumu C57BL/6N ma loxP flanking Mfn2 genes ua uma ona faʻamatalaina muamua (18) ma faʻafefiloi ma isumu L7-Cre (23). O fanau heterozygous faʻalua na maua mai ai na faʻafefiloi ma isumu homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP e faʻatupuina ai ni Purkinje-specific gene knockouts mo Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). I se vaega o le faʻaipoipoga, o le Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) na faʻaofiina e ala i faʻafefiloi faʻaopoopo (20). O faiga uma o manu na faia e tusa ai ma taiala a Europa, faʻaleatunuu ma faʻalapotopotoga ma faʻamaonia e LandesamtfürNatur o Umwelt ma Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Siamani. O galuega i manu e mulimulitaʻi foʻi i taʻiala a le European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
A maeʻa ona faʻamoe le ua o le fafine maʻitaga, ona vavaeʻeseina lea o le pepe o le isumu (E13). Na tipi ese le cortex i le Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) faʻaopoopo i ai le 10 mM Hepes ma tuʻuina atu i ai le Dulbecco's Modified Eagle's Medium o loʻo i ai le papain (20 U/ml) ma le cysteine ​​​​(1μg/ml). Faʻasusu le aano i totonu o le DMEM) ma faʻateʻa ese e ala i le faʻagaʻoina o le enzyme. Ml) i le 37°C mo le 20 minute, ona oloina lea i totonu o le DMEM faʻaopoopo i ai le 10% fetal bovine serum. Na totoina sela i luga o ufiufi tioata ua ufiufi i le polylysine i le mafiafia o le 2×106 i le ipu faʻatoʻaga 6 cm poʻo le mafiafia o le 0.5×105 sela/cm2 mo le suʻesuʻega ata. A maeʻa itula e 4, ona sui lea o le medium i le Neurobasal serum-free medium o loʻo i ai le 1% B27 supplement ma le 0.5 mM GlutaMax. Ona tausia lea o neu i le 37°C ma le 5% CO2 i le taimi atoa o le faʻataʻitaʻiga, ma fafagaina faʻatasi i le vaiaso. Ina ia faʻaosofia le toe tuʻufaʻatasia i totonu o le vitro, 3μl (ipu faʻatoʻaga 24-well) poʻo le 0.5μl (ipu 24-well) o le vector siama AAV9 lea na faʻaaogaina e togafitia ai neu i le aso lona lua i totonu o le vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numera o le katala 105530-AAV9) ma le AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numera o le katala 105545-AAV9).
O le DNA fa'aopoopo a le Mouse Mfn1 ma le Mfn2 (na maua mai le plasmid Addgene #23212 ma le #23213, i le fa'asologa) ua fa'ailogaina i le fa'asologa V5 (GKPIPNPLLGLDST) i le C-terminus, ma ua fa'apipi'i fa'atasi ma le mCherry i totonu o le fa'avaa e ala i le fa'asologa T2A. O le Grx1-roGFP2 o se meaalofa mai le Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). I le suia o le kaseti tdTomato e fa'aaoga ai auala masani o le cloning, na fa'apipi'iina ai le kaseti i totonu o le pAAV-CAG-FLEX-tdTomato backbone (Addgene reference number 28306) e fa'atupu ai le pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ma le pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vectors. O se fuafuaga faapena na faʻaaogaina e faʻatupu ai le vector pulea pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Ina ia faʻatupuina le faufale AAV-shPCx, e manaʻomia se vector plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), lea e aofia ai le faʻasologa o le DNA o loʻo faʻailoa mai ai le shRNA e faʻatatau i le isumu PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). I lalo o le pule a le promoter U6, e faʻaaogaina le mCherry i lalo o le pule a le promoter CMV. O le gaosiga o vectors fesoasoani AAV na faʻatinoina e tusa ai ma faʻatonuga a le kamupani gaosi oloa (Cell Biolabs). I se aotelega, fa'aaoga se plasmid fa'aliliu e tauaveina le mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) fa'aliliuina o le 293AAV sela-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) po'o le Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gene fa'ailoga, fa'apea fo'i ma le fa'ailogaina o le AAV1 capsid protein ma le accessory protein. O le plasmid plasmid plasmid e afifiina, e fa'aaoga ai le metotia o le calcium phosphate. O le siama mata'utia na maua e ala i ta'amilosaga fa'a'aisa-fa'amamago i totonu o se tapu aisa mago/ethanol ma fa'a'ese'ese sela i le phosphate buffered saline (PBS). Sa fa'amamāina le vector AAV e ala i le iodixanol gradient ultracentrifugation e le fa'aauau (24 itula i le 32,000 rpm ma le 4°C) ma fa'aputu fa'atasi e fa'aaoga ai le Amicon ultra-15 centrifugal filter. O le genome titer o le AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX e pei ona fa'amatalaina muamua (54), fuaina e le real-time quantitative PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ma le AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Sa valu ese ni neurons autū i le 1x PBS malulu, fa'aputuina i le pellet, ona fa'afefiloi lea i le 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer o lo'o i ai le phosphatase ma le protease inhibitor (Roche). Sa faia le fuaina o porotini e ala i le fa'aaogaina o le bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific). Ona vaevaeina lea o porotini e ala i le SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ona fa'apipi'i lea i luga o se polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare). Poloka nofoaga e le o fa'apitoa ma fa'asusu i le antibody autū (tagai i le Table S1 mo nisi fa'amatalaga) i le 5% susu i le TBST (Tris-buffered saline ma Tween), la'asaga o le fufuluina ma le antibody lona lua i le TBST Incubate. Fa'asusu i le antibody autū i le po atoa i le +4°C. A uma ona fufulu, fa'aoga le antibody lona lua mo le 2 itula i le vevela o le potu. Mulimuli ane, e ala i le fa'asusuina o le blot lava e tasi i se antibody anti-β-actin, na fa'amaonia ai le uta lava e tasi. Iloa e ala i le liua i le chemiluminescence ma le faʻaleleia atili o le chemiluminescence (GE Healthcare).
O neura na mua'i totoina i luga o ufiufi tioata na fa'amauina i le 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS i le taimi atofaina i le vevela o le potu mo le 10 minute. O ufiufi e muamua fa'asusuina i le 0.1% Triton X-100/PBS mo le 5 minute i le vevela o le potu, ona fa'asusu lea i le blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. I le aso lona lua, na fufuluina ufiufi i le blocking buffer ma fa'asusu i le fluorophore-conjugated secondary antibody talafeagai mo le 2 itula i le vevela o le potu; mulimuli ane, na fufuluina lelei fa'ata'ita'iga i le PBS fa'atasi ai ma le 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) ua valiina i le counterspainted ona fa'amau lea i luga o le microscope slide fa'atasi ai ma le Aqua-Poly/Mount.
Sa fa'amoe isumu (tane ma fafine) e ala i le tuiina o le ketamine (130 mg/kg) ma le xylazine (10 mg/kg) i totonu o le manava ma tu'uina i lalo o le pa'u o le tino i le carprofen analgesic (5 mg/kg). Ma tu'u i totonu o se meafaigaluega stereotactic (Kopf) ua fa'apipi'iina i se ie mafanafana. Fa'aali le ulupo'o ma fa'aaoga se vili nifo e fa'amama ai le vaega o le cerebellar cortex e fetaui ma le mis bone (mai le lambda: si'usi'u 1.8, lateral 1, e fetaui ma lobules IV ma le V). Fa'aaoga se nila tui pi'o e faia ai ma le fa'aeteete se pu la'ititi i le ulupo'o ina ia 'alofia ai le fa'alavelaveina o le vasculature i lalo. Ona fa'aofi malie lea o le tioata manifinifi i totonu o le pu la'ititi (mai le -1.3 i le -1 i le itu ventral o le dura mater), ma tuiina le 200 i le 300 nl AAV i totonu o le micro-injector (Narishige) i tui lima (Narishige) i ni nai taimi i le maualalo o le mamafa i totonu o se vaitaimi e 10 i le 20 minute. A maeʻa ona faʻasusu, tuʻu le kapila mo le isi 10 minute ina ia mafai ai e le siama ona sosolo atoa. A maeʻa ona aveese kapila, ona suʻi lea ma le faʻaeteete le paʻu e faʻaitiitia ai le mumū o le manuʻa ma faʻataga ai le manu e toe malosi. Sa togafitia manu i vailaʻau faʻamālōlō tiga (caspofen) mo ni nai aso talu ona maeʻa le taotoga, ma i le taimi lea na mataʻituina ma le faʻaeteete ai lo latou tulaga faaletino ona fasiotia lea i le taimi atofaina. O faiga uma sa faʻatinoina e tusa ai ma taʻiala a Europa, faʻaleatunuu ma faʻalapotopotoga ma sa faʻamaonia e LandesamtfürNatur o Umwelt ma Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Siamani.
Sa fa'a'umi'umi manu i le ketamine (100 mg/kg) ma le xylazine (10 mg/kg), ma sa fa'asusu muamua le fatu i le 0.1 M PBS, ona sosoo ai lea ma le 4% PFA i le PBS. Sa tipi ese le aano ma fa'amau i le 4% PFA/PBS i le po atoa i le 4°C. Sa fa'aaogaina se naifi gatete (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) e saunia ai vaega sagittal (50 μm le mafiafia) mai le fai'ai ua fa'amau i le PBS. Se'i vagana ua fa'amaoti mai, o le valivaliina o vaega e fe'avea'i sa'oloto sa faia e pei ona fa'amatalaina i luga (13) i le vevela o le potu ma le fa'agae'etia. I se aotelega, muamua, o fasi na maua sa fa'asusuina i le 0.5% Triton X-100/PBS mo le 15 minute i le vevela o le potu; mo nisi epitopes (Pcx ma Shmt2), e ala i le tris-EDTA buffer i le 80°C (PH 9) fa'avevela fasi mo le 25 minute nai lo lenei la'asaga. Sosoo ai, na fa'asusuina vaega i le antibody muamua (tagai i le Laulau S1) i totonu o le blocking buffer (3% BSA/PBS) i le 4°C i le po atoa ma le fa'agae'etia. I le aso na sosoo ai, na fufuluina vaega i le blocking buffer ma fa'asusuina i le fluorophore-conjugated secondary antibody talafeagai mo le 2 itula i le vevela o le potu; mulimuli ane, na fufuluina vaega i le PBS, fa'avali fa'atasi ma le DAPI, ona fa'amau lea i le AquaPolymount i luga o se microscope slide.
O se microscope confocal scanning laser (TCS SP8-X po'o le TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ua fa'apipi'iina i se laser malamalama pa'epa'e ma se laser ultraviolet 405 diode na fa'aaogaina e ata ai le fa'ata'ita'iga. I le fa'aosofiaina o le fluorophore ma le aoina o le fa'ailo i le Hybrid Detector (HyDs), na fa'aaogaina ai le polokalama LAS-X e aoina ai ata fa'aputu e ogatasi ma le Nyquist sampling i le faiga fa'asolosolo: mo paneli e le o ni fuainumera, o fa'ailo e matua'i fa'agaoioia (mo se fa'ata'ita'iga, i sela somatic ma dendrites) mtYFP) Fa'aaoga le HyD e iloa ai le aofa'i o PNs i le faiga BrightR). O le fa'aogaina o le Gating mai le 0.3 i le 6 ns e fa'aitiitia ai le talaaga.
Ata fa'ata'ita'i moni o sela ua fa'avasegaina. A mae'a ona fa'avasegaina i le Neurobasal-A medium o lo'o i ai le 1% B27 supplement ma le 0.5 mM GlutaMax, ona fa'aputuina loa lea o sela i luga o poly-l-lysine-coated glass slides (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826), Ona tu'u lea i le 37°C ma le 5% CO2 mo le 1 itula e fa'ataga ai sela e fa'amautu. Sa faia le ata fa'ata'ita'i moni i luga o se Leica SP8 laser scanning confocal microscope ua fa'apipi'iina i se laser pa'epa'e, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens ma se fa'avevela.
Sa vave ona fa'amoe le isumu i le kaponi taiokesaita ma tipi ese lona ulu, sa vave ona aveese le fai'ai mai le ulupo'o, ma tipi i le 200μm le mafiafia (mo le fa'ata'ita'iga o le fa'ailogaina 13C) po'o le 275μm le mafiafia (mo fa'ata'ita'iga e lua o le photon) o le vaega sagittal ua fa'atumuina i mea nei. O le aisikulimi (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Siamani) ua fa'atumuina i mea nei: 125 mM aisa malulu, fa'atumuina i le kaponi (95% O2 ma le 5% CO2) maualalo le Ca2 + vai fa'apitoa o le cerebrospinal (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0.5 mM CaCl2 ma le 3.5 mM MgCl2 (mamafa osmotic o le 310 i le 330 mmol). Fa'aliliu fasi o le fai'ai ua maua i totonu o se potu a'o le'i fa'asusuina o lo'o i ai le Ca2 + ACSF e maualuga atu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ma le 2.0 mM MgCl2) Medium) pH 7.4 ma le 310 i le 320 mmol).
I le taimi o le faagasologa o le faia o ata, na aveina ai fasi vaega i totonu o se potu faapitoa mo ata, ma faia ai le faataitaiga i lalo o le faaauau pea o le ACSF perfusion i le vevela e tumau mai le 32° i le 33°C. O se microscope scanning laser multiphoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ua faapipiiina i se tioata o le Leica 25x objective (NA 0.95, vai), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) na faaaogaina mo le faia o ata o fasi vaega. FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM o le Grx1-roGFP2. O suiga i le tulaga redox cytoplasmic o PNs na fuaina e le FLIM e lua-photon i fasi sagittal o le faiʻai, lea na faʻatatau ai e le biosensor Grx1-roGFP2 PNs. I le vaega PN, o le fanua mauaina e filifilia pe tusa ma le 50 i le 80 μm i lalo ifo o le fogāʻeleʻele fasi e faʻamautinoa ai o loʻo i ai se PN olaola (o lona uiga, le leai o se fausaga beaded poʻo suiga faʻaletino neuronal i luga o dendrites) ma le sensor roGFP2 faalua lelei ma le AAV e faʻailoa ai le shRNA PCx poʻo lana faʻasologa pulea (taʻitasi e faʻaalia faʻatasi le mCherry). Aoina ata e tasi le faʻaputuga ma le 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Iloa: HyD i totonu, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] ma le averesi o ata i totonu ole 2 i le 3 minute e faʻaaogaina e faʻamautinoa ai o loʻo aoina le tele o photons (1000 photons i le aofaʻi) mo le curve fit. O le maaleale o le Grx1-roGFP2 probe ma le faʻamaoniaina o tulaga o le FLIM na faia e ala i le mataʻituina o le umi o le ola o le roGFP2 pe a faʻaopoopoina le 10 mM H2O2 mai fafo i le perfusion ACSF (e faʻateleina ai le oxidation, ma iʻu ai i le faʻateleina o le umi o le ola), ona faʻaopoopo lea o le 2 mM dithiothreitol (e faʻaitiitia ai le tulaga o le faʻaitiitia, ma iʻu ai i le faʻaitiitia o le umi o le ola) (Ata S8, D i le G). Faʻaaoga le polokalama FLIMfit 5.1.1 e iloilo ai taunuuga na maua, faʻafetaui le piʻo e tasi le exponential decay o le ata atoa i le IRF na fuaina (instrument response function), ma o le χ2 e tusa ma le 1. Mo le fuafuaina o le umi o le ola o se PN e tasi, o le ufimata o loʻo siomia ai le tino o neula na tusia ma le lima, ma o le averesi o le umi o le ola i ufimata taʻitasi na faʻaaogaina mo le fuaina.
Su'esu'ega o le malosiaga o le Mitochondrial. Ina ua mae'a ona fa'atupuina le vaega tu'usa'o i le 100 nM TMRM na fa'aopoopo sa'o i le ACSF ua fa'asusuina mo le 30 minute, na fuaina ai suiga o le malosiaga o le mitochondrial o PNs e ala i se microscope e lua-photon. Na faia le ata o le TMRM e ala i le fa'aosofia o le probe i le 920 nm ma fa'aaoga le HyD i totonu (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) e aoina ai fa'ailo; e ala i le fa'aaogaina o le galu fa'aosofia tutusa ae fa'aaoga se HyD i totonu eseese (FITC: 525/50) e fa'aata ai le mtYFP. Fa'aaoga le plug-in a le Image Calculator a le ImageJ e iloilo ai le malosiaga o le mitochondrial i le tulaga o le sela e tasi. I se aotelega, o le fa'atusatusaga o le plug-in: signal = min (mtYFP, TMRM) e fa'aaoga e fa'ailoa ai le itulagi o le mitochondrial o lo'o fa'aalia ai le fa'ailo TMRM i le Purkinje Somali i le ata confocal e tasi-stack o le auala talafeagai. Ona fuaina lea o le vaega o le pixel i le ufimata e maua mai ai, ona faʻatulagaina lea i luga o le ata tutusa o le threshold single-stack o le mtYFP channel e maua ai le vaega o le mitochondrial e faʻaalia ai le mitochondrial potential.
Sa fa'asa'olotoina le ata i le polokalama Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Mo ata ua uma ona su'eina o ta'i, o le fa'apipi'iina o se ta'i e tasi e faia e fa'aaoga ai le algorithm su'isu'i otometi na saunia e le polokalama LAS-X. A mae'a ona fa'atulagaina le ata, fa'aaoga le ImageJ ma le Adobe Photoshop e fa'agasolo atili ai le ata ma fetu'una'i tutusa le pupula ma le fa'atusatusaga. Fa'aaoga le Adobe Illustrator mo le sauniuniga o ata.
Su'esu'ega o le taula'iga mtDNA. O le aofa'i o manu'a mtDNA na fuaina i luga o vaega o le cerebellar ua fa'ailogaina i antibodies e fa'asaga i le DNA e ala i le confocal microscope. O vaega ta'itasi na faia mo le tino o le sela ma le nucleus o sela ta'itasi, ma o le vaega ta'itasi na fuafuaina e fa'aaoga ai le Multi Measure plug-in (polokalame ImageJ). To'ese le vaega o le nucleus mai le vaega o le tino o le sela e maua ai le vaega o le cytoplasmic. Mulimuli ane, o le Analyze Particles plug-in (polokalame ImageJ) na fa'aaogaina e otometi lava ona fuaina ai vaega o le cytoplasmic DNA o lo'o fa'aalia ai le mtDNA i luga o le ata o le threshold, ma o taunu'uga na maua na fa'atulagaina i le averesi PN o isumu CTRL. O taunu'uga o lo'o fa'aalia o le averesi o le aofa'i o nucleosides i le sela.
Su'esu'ega o le fa'aalia o porotini. Fa'aaoga le plug-in a le Image Calculator a le ImageJ e iloilo ai le fa'aalia o porotini i le PN i le tulaga o le sela e tasi. I se aotelega, i le ata confocal e tasi le vaega o le auala talafeagai, e ala i le fua fa'atatau: signal = min (mtYFP, antibody), o le vaega mitochondrial e fa'aalia ai le immunoreactivity i se antibody patino i Purkina e fa'ailoaina. Ona fa'atatauina lea o le vaega o pixel i le ufimata e maua mai ai, ona fa'atulagaina lea i luga o le ata fa'atulagaina e tasi o le auala mtYFP e maua ai le vaega mitochondrial o le porotini o lo'o fa'aalia.
Su'esu'ega o le mafiafia o sela Purkinje. O le Cell Counter plug-in o le ImageJ na fa'aaogaina e iloilo ai le mafiafia o Purkinje e ala i le vaevaeina o le aofa'i o sela Purkinje na faitauina i le umi o le mama o le cerebellar o lo'o i ai sela na faitauina.
Sauniuniga ma le aoina o faʻataʻitaʻiga. O faiʻai mai le vaega faʻatonutonu ma isumu Mfn2cKO na faʻamauina i le 2% PFA/2.5% glutaraldehyde i le 0.1 M phosphate buffer (PB), ona saunia lea o vaega o le coronal e faʻaaoga ai ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Mafiafia 50 i le 60 μm) Ona faʻamau lea i le PB buffer i le 1% os tetraoxide ma le 1.5% potassium ferrocyanide i le vevela o le potu mo le 1 itula. Na fufuluina vaega faatolu i le vai faʻamamā, ona valivali lea i le 70% ethanol o loʻo i ai le 1% uranyl acetate mo le 20 minute. Ona faʻamago lea o vaega i le ava malosi faʻavasegaina ma faʻapipiʻi i le Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, numera o le kataloga 14040) i le va o slides tioata ua ufiufi i le silicon, ma mulimuli ane i le 60°C Polymerize i totonu o le ogaumu mo le 48 itula. Sa filifilia le vaega o le cerebellar cortex ma tipiina ni vaega manifinifi e 50 nm i luga o le Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) ma tipiina i luga o se grid apamemea 2 × 1 mm ua ufiufi i le polystyrene film. Sa valiina vaega i se vaifofo o le 4% uranyl acetate i le H2O mo le 10 minute, fufuluina i le H2O i ni nai taimi, ona fufuluina lea i le Reynolds lead citrate i le H2O mo le 10 minute, ona fufuluina lea i le H2O i ni nai taimi. Sa pu'eina ata maikokalafi i se microscope eletise fa'asalalau Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ISA) e fa'aaoga ai se meapueata numera TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, ISA). Siamani).
Mo isumu ua a'afia i le AAV, na vaevaeina le fai'ai ma tipiina i se vaega sagittal e 1 mm le mafiafia, ma su'esu'eina le cerebellum e fa'aaoga ai se microscope fluorescence e iloa ai le mama ua a'afia i le AAV (o lona uiga, o le mCherry expressing). Na'o fa'ata'ita'iga ia e mafua ai ona maualuga le lelei o le transduction o le vaega o le sela Purkinje (toetoe lava o le vaega atoa) i totonu o mama cerebellar e lua sosoo e fa'aaogaina. O le matasele AAV-transduced na microdissected mo le po atoa pe a uma ona fa'amau (4% PFA ma le 2.5% glutaraldehyde i le 0.1 M cocoate buffer) ma fa'agasolo atili. Mo le fa'apipi'iina o le EPON, na fufuluina le a'ano ua fa'amau i le 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), ma fa'afefiloi i le 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) i le 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) mo le 4 itula, ona fufulu lea mo le 2 itula. Toe fai fa'atolu i le 0.1 M cocamide buffer. Mulimuli ane, o le faasologa o le ethanol ua siitia i luga na faaaogaina e fa'asusu ai vaifofo ethanol taitasi i le 4°C mo le 15 minute e fa'amago ai le a'ano. Na fa'aliliuina le a'ano i le propylene oxide ma fa'asusu i le po atoa i le EPON (Sigma-Aldrich) i le 4°C. Tu'u le a'ano i totonu o le EPON fou i le vevela o le potu mo le 2 itula, ona fa'apipi'i lea i le 62°C mo le 72 itula. Faaaoga se ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) ma se naifi taimane (Diatome, Biel, Switzerland) e tipi ai ni vaega manifinifi e 70 nm, ma valivali i le 1.5% uranyl acetate mo le 15 minute i le 37°C, ma valivali i le vaifofo lead citrate mo le 4 minute. O ata eletise na pu'eina e fa'aaoga ai se JEM-2100 Plus transmission electron microscope (JEOL) ua fa'apipi'iina i le Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ma le polokalama DigitalMicrograph (Gatan). Mo le au'ili'iliga, sa maua maikokalafi eletise i le fa'alauteleina numera 5000× po'o le 10,000×.
Su'esu'ega fa'aletino o mitochondria. Mo su'esu'ega uma, o foliga o mitochondria ta'itasi na fa'amatalaina ma le lima i ata numera e fa'aaoga ai le polokalama ImageJ. O lo'o su'esu'eina fa'asologa eseese o foliga. O le mafiafia o Mitochondrial e fa'aalia o se pasene e maua mai i le vaevaeina o le aofa'i atoa o le mitochondrial o sela ta'itasi i le vaega o le cytoplasm (cytoplasm area = cell area-cell nucleus area) × 100. O le lapotopoto o mitochondria e fuafuaina i le fua fa'atatau [4π∙(area/perimeter 2)]. O le ista morphology o mitochondria na su'esu'eina ma vaevaeina i ni vaega se lua ("tubular" ma le "blister") e tusa ai ma o latou foliga autu.
Au'ili'iliga o le numera ma le mafiafia o le Autophagosome/lysosome. Faaaoga le polokalama ImageJ e fa'ailoa ai lima ia foliga o autophagosome/lysosome ta'itasi i le ata numera. O le vaega o le Autophagosome/lysosome e fa'aalia o se pasene e fuafuaina e ala i le vaevaeina o le aofa'i o le vaega o le fausaga o le autophagosome/lysosome o sela ta'itasi i le vaega o le cytoplasm (vaega o le cytoplasm=vaega o le sela-vaega o le nucleus)×100. O le mafiafia o autophagosomes/lysosomes e fuafuaina e ala i le vaevaeina o le aofa'i atoa i le aofa'i o fausaga o le autophagosome/lysosome i le sela (i tulaga o le vaega o le cytoplasm) (vaega o le cytoplasm = vaega o le sela-vaega o le nucleus).
Fa'ailogaina mo le vaevaeina fa'afuase'i ma le sauniuniga o fa'ata'ita'iga. Mo fa'ata'ita'iga e mana'omia ai le fa'ailogaina o le kulukose, fa'aliliu fasi fai'ai fa'afuase'i i totonu o se potu a'o le'i fa'asusuina, lea e aofia ai le kaponi fa'atumuina (95% O2 ma le 5% CO2), Ca2 + ACSF maualuga (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ma le 2.0 mM MgCl2, fetu'una'i i le pH 7.4 ma le 310 i le 320 mOsm), lea o le kulukose o le 13C 6- Suiga o le kulukose (Eurisotop, numera o le lisi CLM-1396). Mo fa'ata'ita'iga e mana'omia ai le fa'ailogaina o le pyruvate, fa'aliliu vaega o le fai'ai i le Ca2 + ACSF e maualuga atu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ma fa'aopoopo le 2.0mM MgCl2, fetu'una'i i le pH 7.4 ma le 310 i le 320mOsm), ma fa'aopoopo le 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, numera o le lisi CLM-1082). Fa'asusu vaega mo le 90 minute i le 37°C. I le fa'ai'uga o le fa'ata'ita'iga, sa vave ona fufuluina vaega i se vaifofo vai (pH 7.4) o lo'o i ai le 75 mM ammonium carbonate, ona fa'afefiloi lea i le 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: vai. A maeʻa ona faʻapuna vaega i luga o le aisa mo le 30 minute, ona faʻacentrifuge lea o faʻataʻitaʻiga i le 21,000 kalama mo le 10 minute i le 4°C, ma faʻamago le supernatant manino i totonu o le SpeedVac concentrator. O le metabolite pellet mago na maua mai ai na teuina i le -80°C seʻia oʻo i le taimi e suʻesuʻe ai.
Su'esu'ega o le chromatography vai-mass spectrometry o le 13 amino acids ua fa'ailogaina i le C. Mo le su'esu'ega o le chromatography vai-mass spectrometry (LC-MS), na toe fa'asusuina le metabolite pellet i le 75μl o le vai LC-MS (Honeywell). A mae'a ona fa'a-centrifugation i le 21,000 g mo le 5 minute i le 4°C, na fa'aaogaina le 20 μl o le supernatant ua fa'amalamalama mo le su'esu'ega o le amino acid flux, a'o le vaega o totoe o le extract na fa'aaogaina loa mo le su'esu'ega o le anion (tagai i lalo). Na faia le su'esu'ega o le amino acid e fa'aaoga ai le benzoyl chloride derivatization protocol na fa'amatalaina muamua (55, 56). I le la'asaga muamua, na fa'aopoopoina le 10μl o le 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) i le 20μl o le metabolite extract, ona fa'aopoopoina lea o le 10μl o le 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) i le LC grade ACN. Sa fa'avilivili pu'upu'u le fa'ata'ita'iga ona fa'acentrifuge lea i le 21,000 g mo le 5 minute i le 20°C. Fa'aliliu le supernatant ua fa'amama i totonu o se fagu autosampler 2 ml fa'atasi ai ma se fa'aofi tioata conical (200 μl le voluma). Sa au'ili'iliina fa'ata'ita'iga e fa'aaoga ai le Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) ua feso'ota'i i le Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Mo le au'ili'iliga, 2μl o le fa'ata'ita'iga na maua mai ai sa tuiina i totonu o se koluma silica T3 malosi tele e 100×1.0 mm (Waters) o lo'o i ai ni vaega e 1.8μm. O le fua fa'atatau o le tafe e 100μl/min, ma o le buffer system e aofia ai le buffer A (10 mM ammonium formate ma le 0.15% formic acid i le vai) ma le buffer B (ACN). O le gradient e fa'apea: 0%B i le 0 minute; 0%B. 0 i le 15% B i le 0 i le 0.1 minute; 15 i le 17% B i le 0.1 i le 0.5 minute; B i le 17 i le 55% i le 0.5 i le 14 minute; B i le 55 i le 70% i le 14 i le 14.5 minute; i le 14.5 i le 70 i le 100% B i le 18 minute; 100% B i le 18 i le 19 minute; 100 i le 0% B i le 19 i le 19.1 minute; 0% B i le 19.1 i le 28 minute (55, 56). O le QE-HF mass spectrometer e fa'agaoioia i le positive ionization mode ma le mass range o le m/z (mass/charge ratio) o le 50 i le 750. O le resolution fa'aoga e 60,000, ma le gain control (AGC) ion target na maua e 3×106, ma le maximum ion time e 100 milliseconds. O le heated electrospray ionization source (ESI) e fa'agaoioia i le spray voltage o le 3.5 kV, o le capillary temperature o le 250°C, o le sheath airflow o le 60 AU (arbitrary units), ma le auxiliary airflow o le 20 AU. 250°C. O le S lens ua setiina i le 60 AU.
Su'esu'ega o le anion chromatography-MS o le 13C organic acids ua fa'ailogaina. O le metabolite precipitate na totoe (55μl) na su'esu'eina e fa'aaoga ai le Dionex ion chromatography system (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ua feso'ota'i i le QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). I se aotelega, 5μl o le metabolite extract na tuiina i totonu o le Dionex IonPac AS11-HC column ua fa'apipi'iina i le HPLC (2 mm × 250 mm, particle size 4μm, Thermo Fisher Scientific) i le push-in partial loop mode ma le filling ratio o le 1. ) Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). O le vevela o le column e tausia i le 30°C, ma ua setiina le autosampler i le 6°C. Faaaoga se potassium hydroxide cartridge ua saunia ma le vai deionized e fa'atupu ai se potassium hydroxide gradient e ala i le eluent generator. Vavae'eseina o metabolites i le fua fa'atatau o le tafe o le 380μl/min, fa'aaoga le gradient lenei: 0 i le 3 minute, 10 mM KOH; 3 i le 12 minute, 10 i le 50 mM KOH; 12 i le 19 minute, 50 i le 100 mM KOH; 19 i le 21 minute, 100 mM KOH; 21 i le 21.5 minute, 100 i le 10 mM KOH. Na toe fa'apaleni le koluma i lalo o le 10 mM KOH mo le 8.5 minute.
O metabolites ua fa'amamāina ua tu'ufa'atasia ma se vaitafe fa'aopoopo isopropanol e 150μl/min pe a uma le koluma ona fa'asino lea i se spectrometer mass maualuga e fa'agaoioia i le faiga negative ionization. O lo'o mata'ituina e le MS le vaega o le mass mai le m/z 50 i le 750 ma se iugafono o le 60,000. Ua setiina le AGC i le 1×106, ma o le taimi maualuga o le ion e tausia i le 100 ms. O le puna vevela ESI na fa'agaoioia i le voltage fa'asusu o le 3.5 kV. O isi fa'atulagaga o le puna ion e fa'apea: vevela o le capillary 275°C; tafega o le kesi i totonu o le sheath, 60 AU; tafega o le kesi fesoasoani, 20 AU i le 300°C, ma le setiina o le tioata S i le 60 AU.
Su'esu'ega o fa'amaumauga o metabolites ua fa'ailogaina i le 13C. Fa'aaoga le polokalama TraceFinder (lomiga 4.2, Thermo Fisher Scientific) mo le su'esu'eina o fa'amaumauga o le fua fa'atatau o le isotope. O le fa'asinomaga o vaila'au ta'itasi na fa'amaonia e se vaila'au fa'asinomaga fa'atuatuaina ma su'esu'eina tuto'atasi. Ina ia faia le su'esu'ega o le fa'amauoa o le isotope, o le vaega o le chromatogram ion na fa'a'esea (XIC) o isotope ta'itasi 13C (Mn) na fa'a'esea mai le [M + H] +, lea o le n o le numera kaponi o le vaila'au fa'amoemoeina, e fa'aaoga e su'esu'e ai amino acids po'o le [MH] + e fa'aaoga e su'esu'e ai anions. O le sa'o o le mamafa o le XIC e itiiti ifo i le lima vaega i le miliona, ma o le sa'o o le RT e 0.05 minute. O le su'esu'ega fa'amauoa e faia e ala i le fuafuaina o le fua fa'atatau o isotope ta'itasi ua iloa i le aofa'i o isotopes uma o le vaila'au talafeagai. O nei fua fa'atatau e tu'uina atu o ni pasene mo isotope ta'itasi, ma o taunu'uga e fa'aalia o ni molar percent enrichment (MPE), e pei ona fa'amatalaina muamua (42).
O le pellet neuron ua fa'a'aisa na fa'afefiloi i le 80% methanol malulu (v/v), fa'avilivili, ma fa'a'olo'olo i le -20°C mo le 30 minute. Toe fa'avilivili le fa'ata'ita'iga ma fa'agae'e i le +4°C mo le 30 minute. Na fa'avilivili le fa'ata'ita'iga i le 21,000 g mo le 5 minute i le 4°C, ona aoina lea o le supernatant na maua ma fa'amago e fa'aaoga ai le SpeedVac concentrator i le 25°C mo su'esu'ega mulimuli ane. E pei ona fa'amatalaina i luga, na faia le su'esu'ega LC-MS i amino acids o sela ua fa'avasegaina. I le fa'aaogaina o le TraceFinder (lomiga 4.2, Thermo Fisher Scientific), na faia le su'esu'ega o fa'amaumauga e fa'aaoga ai le monoisotopic mass o vaila'au ta'itasi. Na faia le fa'atulagaina o le quantile o fa'amaumauga metabolite e fa'aaoga ai le afifi polokalama preprocessCore (57).
Sauniuniga o le tipi. Sa vave ona fa'amoe le isumu i le kaponi taiokesaita ma tipi ese lona ulu, sa vave ona aveese le fai'ai mai le ulupo'o, ma fa'aaoga le naifi gatete ua fa'atumuina i le aisa (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Siamani) e tipi ai i ni vaega sagittal e 300 i le 375 μm. Fa'asu'u kaponi malulu (95% O2 ma le 5% CO2) Maualalo Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ma le 6.0 mM MgCl2. Fetuuna'i i le pH 7.4 ma le 310 i le 330 mOsm). Fa'aliliu fasi o le fai'ai ua maua i totonu o se potu o lo'o i ai le Ca2 + ACSF e maualuga atu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 ma le mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ma le 310 i le 320 mOsm). Teu fasi mo le 20 i le 30 minute ina ia mafai ona toe fa'afo'isia a'o le'i fa'amaumauina.
pu'ega. O se tulaga o le microscope ua fa'apipi'iina i se potu pu'ega tumau ma se tioata fa'atofu vai 20x (Scientifica) na fa'aaogaina mo pu'ega uma. O sela Purkinje atonu na fa'ailoaina e ala i le (i) tele o le tino, (ii) tulaga fa'anatura o le cerebellum, ma le (iii) fa'aalia o le fluorescent mtYFP reporter gene. O le patch pipette ma le tete'e o le pito i le 5 i le 11 megohms e tosoina i fafo e se capillary tioata borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Siamani) ma se pipette fa'alava Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). O pu'ega uma na faia e le ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Siamani), lea na pulea e le polokalama Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). O le fa'ata'ita'iga na pu'eina i le fua fa'atatau o le 12.5 kHz. O le faailoilo e fa'amamāina i ni fa'amama pu'upu'u se lua a Bessel ma ni fa'asologa e tipi ese ai le leo e 1.3 ma le 10 kHz. O le gafatia o le membrane ma le pipette e fa'amalieina e le matagaluega fa'amalieina e fa'aaoga ai le amplifier. O fa'ata'ita'iga uma na faia i lalo o le pulea e se meapueata Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Siamani), lea na pulea e le polokalama Hokawo (lomiga 2.8, Hamamatsu, Gerden, Siamani).
Fa'atulagaga masani o le sela atoa ma le au'ili'iliga. A'o le'i fa'amaumauina, fa'atumu le pipette i le vai fa'alotoifale o lo'o i ai mea nei: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) ma le 10.0 mM creatinine phosphate na fetu'una'i i le pH 7.25, ma o le mamafa o le osmotic e 290 mOsm (sucrose). I le taimi lava na mae'a ai ona fa'aogaina le malosi o le 0 pA e malepe ai le membrane, na fuaina ai le gafatia o le membrane malolo. O le tete'e i totonu e fuaina e ala i le fa'aogaina o tafega hyperpolarized o le -40, -30, -20, ma le -10 pA. Fuafua le tele o le tali atu o le voltage ma fa'aaoga le tulafono a Ohm e fuafua ai le tete'e i totonu. Sa faamaumauina le gaioiga faafuasei i totonu o se fa'amau voltage mo le 5 minute, ma sa fa'ailoa ma fuaina le sPSC i le Igor Pro (lomiga 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, ISA) e fa'aaoga ai se tusitusiga fa'ailoaina semi-automatic. O le IV curve ma le steady-state current e fuaina e ala i le fa'amauina o le maa i ni potentials eseese (amata mai le -110 mV) ma fa'ateleina le voltage i la'asaga e 5 mV. O le gaosiga o le AP sa fa'ata'ita'iina e ala i le fa'aogaina o se depolarizing current. Fa'amau le cell i le -70 mV a'o fa'aogaina se depolarizing current pulse. Fa'asa'o le la'asaga o le iunite fa'amaumauga ta'itasi ta'itasi (10 i le 60 pA). Fuafua le maualuga o le AP frequency e ala i le faitauina lima o pulse spikes e mafua ai le maualuga o le AP frequency. O le AP threshold e su'esu'eina e ala i le fa'aogaina o le lona lua derivative o le depolarization pulse lea e muamua fa'aosofia ai le tasi pe sili atu APs.
Fa'atulagaina ma le au'ili'iliga o le patch ua pu. Fa'atino le fa'amaumauga o le patch ua pu e fa'aaoga ai fa'atonuga masani. Fa'aaoga se pipette e leai se ATP ma le GTP e le o iai mea nei: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ma le 2 mM MgCl2, ma fetu'una'i i le pH 7.2 (fa'aaoga le KOH). E aveese le ATP ma le GTP mai le fofo i totonu o le sela e puipuia ai le le mafai ona pulea o le membrane o le sela. O le patch pipette ua fa'atumuina i se fofo i totonu o lo'o iai le amphotericin (pe tusa ma le 200 i le 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) e maua ai se fa'amaumauga o le patch ua pu. Na fa'a'asu'u le Amphotericin i le dimethyl sulfoxide (tulaga mulimuli: 0.1 i le 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). O le tulaga o le DMSO na fa'aaogaina e leai se a'afiaga tele i neurons na su'esu'eina. I le taimi o le faiga o le tuiina, sa mata'ituina pea le tete'e o le alavai (Ra), ma amata le fa'ata'ita'iga ina ua mae'a ona mautu le malosi o le Ra ma le AP (20-40 minute). O gaioiga fa'afuase'i e fuaina i totonu o se fa'amau voltage ma/po'o le eletise mo le 2 i le 5 minute. Sa faia le su'esu'ega o fa'amaumauga e fa'aaoga ai le Igor Pro (lomiga 7.05.2, WaveMetrics, ISA), Excel (lomiga 2010, Microsoft Corporation, Redmond, ISA) ma le GraphPad Prism (lomiga 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Ina ia iloa ai AP fa'afuase'i, e fa'aaoga le plug-in a le IgorPro's NeuroMatic v3.0c. Fa'ailoa otometi AP e fa'aaoga ai se tapula'a ua tu'uina atu, lea e fetu'una'i ta'itasi mo fa'amaumauga ta'itasi. Fa'aaoga le vaeluaga o le spike, fuafua le tele o le spike ma le tele o le spike vave maualuga ma le averesi o le tele o le spike.
PN vavae'ese. I le fetu'una'i i le fa'atulagaga na lolomiina muamua, na fa'amamāina PNs mai le cerebellum o le isumu i se tulaga fa'apitoa (58). I se aotelega, na tipi ese le cerebellum ma olo i totonu o se vaila'au malulu tele [e aunoa ma le HBSS Ca2+ ma le Mg2+, fa'aopoopo i ai le 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) ma le streptomycin (0.05 mg/ml)], ona fa'a'ele'ele lea o le vaila'au i le papain [HBSS, fa'aopoopo i ai le 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) ma le deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Togafitia mo le 30 minute i le 30°C. Fufulu muamua aano o manu i totonu o le vailaʻau HBSS o loʻo i ai le mucus o le fuamoa (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ma le DNase (0.1 mg/ml) i le vevela o le potu e puipuia ai le faʻagaʻoina o le enisima, ona faʻapipiʻi lea i totonu o le vailaʻau HBSS o loʻo i ai le 20 mM glucose. O le olo mālie i totonu o le HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) ma le DNase (0.1 mg/ml) e faʻasaʻoloto ai sela taʻitasi. O le faʻasusuina o sela na maua mai na faʻamamāina i totonu o se masini faʻamama sela 70μm, ona faʻaputuina lea o sela i le centrifugation (1110 rpm, 5 minute, 4°C) ma toe faʻasusu i totonu o le vailaʻau faʻavasega [HBSS, faʻaopoopo i ai le 20 mM glucose, 20% fetal bovine) serum, penicillin (50 U/ml) ma le streptomycin (0.05 mg/ml)]; iloilo le ola o le sela i le propidium iodide ma fetuʻunaʻi le mafiafia o le sela i le 1×106 i le 2×106 sela/ml. A'o le'i faia le flow cytometry, sa fa'amamāina le fa'asusuga e ala i se strainer 50 μm cell.
O le flow cytometer. Sa faia le fa'avasegaina o sela i le 4°C e fa'aaoga ai le masini FACSAria III (BD Biosciences) ma le polokalama FACSDiva (BD Biosciences, lomiga 8.0.1). Sa fa'avasegaina le fa'aputuga o sela e fa'aaoga ai le 100 μm nozzle i lalo o le mamafa o le 20 psi i le fua faatatau o le ~2800 mea tutupu/sekone. Talu ai o tulaga masani o le gating (tele o sela, fa'ailogaina o bimodal, ma uiga fa'asalalau) e le mafai ona fa'amautinoa le sa'o o le vavae'eseina o le PN mai isi ituaiga sela, o le fuafuaga o le gating ua fa'atulaga e fa'avae i luga o le fa'atusatusaga tu'usa'o o le malosi o le YFP ma le autofluorescence i le mitoYFP+ ​​​​ma le mitoYFP − Mice pulea. E fa'aosofia le YFP e ala i le fa'amalamalamaina o le fa'ata'ita'iga i se laina laser 488 nm, ma e iloa le fa'ailoga e fa'aaoga ai le 530/30 nm band pass filter. I isumu mitoYFP+, o le malosi fa'atatau o le Rosa26-mitoYFP reporter gene e fa'aaoga fo'i e iloa ai vaega o le tino neuronal ma le axon. Ua fa'aosofia le 7-AAD i le laser samasama 561 nm ma iloa i le 675/20 nm bandpass filter e aveese ai sela ua mate. Ina ia vavae'ese astrocytes i le taimi e tasi, na valiina le fa'a'au'au o le sela i le ACSA-2-APC, ona fa'avevela lea o le fa'ata'ita'iga i le laina laser 640 nm, ma fa'aaoga le 660/20 nm bandpass filter e iloa ai le fa'ailo.
O sela na aoina na fa'aputuina i le centrifugation (1110 rpm, 5 minute, 4°C) ma teuina i le -80°C se'ia o'o ina fa'aaogaina. O isumu Mfn2cKO ma a latou tama'i isumu e fa'avasegaina i le aso lava e tasi e fa'aitiitia ai le fesuisuia'iga o faiga fa'atino. O le fa'aalia ma le au'ili'iliga o fa'amaumauga FACS na fa'atinoina e fa'aaoga ai le polokalama FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, ISA).
E pei ona taʻua i luga (59), o le PCR i le taimi moni e faʻaaogaina e vavaeʻese ai le DNA mai neurons ua faʻavasegaina mo le faʻatusatusaga o le mtDNA mulimuli ane. O le linearity ma le threshold sensitivity na muamua faʻataʻitaʻiina e ala i le faʻatinoina o le qPCR i luga o numera eseese o sela. I se aotelega, aoina le 300 PN i totonu o se lysis buffer e aofia ai le 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ma le proteinase K (200 ng/ml) ma faʻasusu i le 55°C 120 minute. Na toe faʻasusuina sela i le 95°C mo le 10 minute e faʻamautinoa ai le faʻagata atoatoa o le proteinase K. I le faʻaaogaina o se TaqMan probe (Thermo Fisher) e faʻapitoa i le mt-Nd1, na fuaina ai le mtDNA e ala i le semi-quantitative PCR i le 7900HT Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific). Saienisi, numera o le lisi o fa'amaumauga Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numera o le lisi o fa'amaumauga AIVI3E8) ma le 18S (Thermo Fisher Scientific, numera o le lisi o fa'amaumauga Hs99999901_s1) genes.
Sauniuniga o le fa'ata'ita'iga o le proteome. I le fa'avevela o le vaila'au i le 95°C mo le 10 minute ma le sonicating, i totonu o le lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide ma le 100 mM tris-Lyse frozen neuron pellets i le HCl]. I luga o le Bioruptor (Diagenode) mo le 10 minute (30 sekone pulse / 30 sekone vaitaimi malolo). Na fa'avaivaia le fa'ata'ita'iga i le 1:10 i le 20 mM tris-HCl (pH 8.0), fa'afefiloi ma le 300 ng trypsin gold (Promega), ma fa'asusu i le po atoa i le 37°C e ausia ai le fa'agase atoatoa. I le aso lona lua, na centrifuge ai le fa'ata'ita'iga i le 20,000 g mo le 20 minute. Na fa'avaivaia le supernatant i le 0.1% formic acid, ma na fa'amama le vaila'au i le StageTips na faia e ia lava. Sa fa'amago le fa'ata'ita'iga i totonu o se meafaigaluega SpeedVac (Eppendorf concentrator fa'aopoopo 5305) i le 45°C, ona fa'a'ofu lea o le peptide i le 0.1% formic acid. Sa saunia fa'atasi uma fa'ata'ita'iga e le tagata lava e tasi. Ina ia iloiloina fa'ata'ita'iga astrocyte, e 4 μg peptides ua fa'a'ofuina na fa'ailogaina i se tandem mass tag (TMT10plex, numera o le kataloga 90110, Thermo Fisher Scientific) fa'atasi ai ma le fua fa'atatau o le peptide i le TMT reagent o le 1:20. Mo le fa'ailogaina o le TMT, 0.8 mg o le TMT reagent na toe fa'a'ofuina i le 70 μl o le anhydrous ACN, ma o le peptide mago na toe fa'afefiloi i le 9 μl o le 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), lea na fa'aopoopo i ai le 7 μl o le TMT reagent i le ACN. O le malosi o le 43.75%. A mae'a le 60 minute o le fa'asusuina, sa fa'a'ofuina le tali atu i le 2 μl o le 5% hydroxylamine. O peptides ua fa'ailogaina sa aoina, fa'amago, toe fa'asusu i le 200μl o le 0.1% formic acid (FA), vaevaeina i ni vaega se lua, ona aveese lea o le masima e fa'aaoga ai le StageTips na faia e i latou lava. Fa'aaoga le UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), o se tasi o vaega e lua sa vaevaeina i luga o se koluma chromatographic Acquity 1mm x 150mm ua fa'atumuina i ni vaega C18 e 130Å1.7μm (Waters, catalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Vavae'ese peptides i le fua fa'atatau o le 30μl/min, vavae'ese mai le 1% i le 50% buffer B mo le 85 minute ma se gradient stepwise o le 96 minute, mai le 50% i le 95% buffer B mo le 3 minute, ona 8 minute lea mo le 95% Buffer B; O le Buffer A o le 5% ACN ma le 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), ma le buffer B o le 80% ACN ma le 10 mM ABC. Aoina ni vaega i minute e 3 ma tuufaatasi i ni vaega se lua (1 + 17, 2 + 18, ma isi) ma faamago i totonu o se vacuum centrifuge.
Su'esu'ega LC-MS/MS. Mo le spectrometry o le tele, o peptides (numera r119.aq) na vaevaeina i luga o se koluma su'esu'e PicoFrit e 25 cm, 75 μm le lautele i totonu (lens fou fa'amoemoe, numera vaega PF7508250) na fa'apipi'iina i le 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), Fa'aaoga le EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Siamani). Na tausia le koluma i le 50°C. O Buffers A ma le B o le 0.1% formic acid i le vai ma le 0.1% formic acid i le 80% ACN, i le fa'asologa. Na vaevaeina peptides mai le 6% i le 31% buffer B mo le 65 minute ma mai le 31% i le 50% buffer B mo le 5 minute ma le gradient o le 200 nl/min. O peptides na eluted na iloiloina i luga o le Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). O le fuaina o le peptide precursor m/z e faia i se iugafono o le 120,000 i le va o le 350 i le 1500 m/z. I le faʻaaogaina o le 27% o le malosi o le fetoʻai masani, o le precursor sili ona malosi ma se tulaga o le totogi o le 2 i le 6 e filifilia mo le vaevaega o le C trap dissociation (HCD) maualuga le malosi. O le taimi o le taamilosaga ua setiina i le 1 s. O le tau m/z o le fasi peptide na fuaina i le ion trap e faʻaaoga ai le sini AGC aupito laʻititi o le 5 × 104 ma le taimi maualuga o le tui o le 86 ms. A maeʻa le fragmentation, ona tuʻuina lea o le precursor i luga o le lisi faʻateʻaina faʻaonaponei mo le 45 s. Sa vaevaeina peptides ua fa'ailogaina i le TMT i luga o le koluma Acclaim PepMap e 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numera o le kataloga 164942), ma sa iloiloina le migration spectra i luga o le Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ua fa'apipi'iina i masini high-field asymmetric waveform ions (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) e fa'agaoioia i le lua compensation voltages o le −50 ma le −70 V. O le MS3 ua filifilia e fa'atatau i le synchronization precursor e fa'aaogaina mo le fuaina o le TMT report ion signal. O le vavaeeseina o le peptide sa faia i luga o le EASY-nLC 1200, e fa'aaoga ai le 90% linear gradient elution, fa'atasi ai ma le buffer concentration o le 6% i le 31%; o le buffer A e 0.1% FA, ma o le buffer B e 0.1% FA ma le 80% ACN. O le analytical column e fa'agaoioia i le 50°C. Fa'aaoga le FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) e vaevaeina ai le faila muamua e tusa ai ma le FAIMS compensation voltage.
Fa'ailoaina ma le fa'atusatusaina o porotini. Fa'aaoga le afi su'esu'e tu'ufa'atasi a Andromeda, na su'esu'eina fa'amaumauga muamua e fa'aaoga ai le MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). I le fa'aopoopoga i le Cre recombinase ma le YFP sequences na maua mai Aequorea victoria, na su'eina fo'i le peptide fragment spectra mo le canonical sequence ma le isoform sequence o le isumu reference proteome (Proteome ID UP000000589, na sii maia mai UniProt ia Me 2017). O le Methionine oxidation ma le protein N-terminal acetylation na fa'atulaga o ni suiga fesuisuia'i; o le cysteine ​​​​carbamoyl methylation na fa'atulaga o ni suiga tumau. O fa'asologa o le digestion ua fa'atulaga i le "specificity" ma le "trypsin/P". O le aofa'i maualalo o peptides ma razor peptides na fa'aaogaina mo le fa'ailoaina o porotini o le 1; o le aofa'i maualalo o peptides tulaga ese o le 0. I lalo o tuutuuga o le peptide map matching, o le fua fa'atatau o le fa'ailoaina o porotini o le 0.01. Ua fa'agaoioia le filifiliga "Second Peptide". Faaaoga le filifiliga "fetaui i le va o tamo'ega" e fa'aliliu ai fa'ailoga manuia i le va o faila muamua eseese. Faaaoga le LFQ minimum ratio count 1 mo le label-free quantification (LFQ) (60). O le malosi o le LFQ e fa'amama mo le itiiti ifo ma le lua tau aoga i le itiiti ifo ma le tasi le vaega genotype i taimi ta'itasi, ma e fa'aopoopoina mai se tufatufaga masani ma le lautele o le . 0.3 ma agai i lalo 1.8. Faaaoga le Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) ma le R (https://r-project.org/) e iloilo ai taunuuga o le LFQ. O se t test feololo lua-ala mai le afifi polokalama limma na fa'aaogaina mo le auiliiliga o le fa'aalia eseese (61). O le auiliiliga o fa'amatalaga su'esu'e e fa'atino e fa'aaoga ai le ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ma le pheatmap. O fa'amatalaga proteomics e fa'avae i luga o le TMT na iloiloina e fa'aaoga ai le MaxQuant version 1.6.10.43. Sailiili mo faʻamaumauga mata o le proteomics mai le faʻamaumauga a le UniProt mo le proteomics o tagata, lea na sii mai ia Setema 2018. O le auʻiliʻiliga e aofia ai le isotope pureness correction factor na saunia e le kamupani gaosi oloa. Faaaoga le limma i le R mo le auʻiliʻiliga o le eseesega o le faʻaalia. O faʻamaumauga muamua, taunuuga o le sailiga o faʻamaumauga, ma le faiga o le auʻiliʻiliga o faʻamaumauga ma taunuuga o loʻo teuina uma i le ProteomeXchange alliance e ala i le PRIDE partner repository faatasi ai ma le data set identifier PXD019690.
O fa'amatalaga fa'atino e fa'amauoa ai le au'ili'iliga. O le meafaigaluega Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) na fa'aaogaina e fuafua ai le tamaoaiga o fa'amatalaga fa'atino o le seti o fa'amaumauga i le 8 vaiaso (Ata 1). I se aotelega, o le lisi o porotini fa'atatau na maua mai le au'ili'iliga o fa'amaumauga LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) e fa'aaogaina fa'atasi ai ma ta'iala fa'amama nei: Ua filifilia le Mus musculus o le ituaiga ma le talaaga, ma o le vaega e fa'aalia ai le taua o le P na fetu'una'i e Benjamini mo le fa'amauoa 0.05 pe maualalo ifo e manatu e taua. Mo lenei kalafi, o vaega pito i luga e lima o lo'o fa'aopoopo i vaega ta'itasi e fa'avae i luga o le taua o le P ua fetu'una'i o lo'o fa'aalia. I le fa'aaogaina o le tele o t-test, i le fa'aaogaina o le polokalame fa'amalosi laina lua-vaega a Benjamini, Krieger, ma Yekutieli (Q = 5%), o le au'ili'iliga o le fa'aalia o porotini i le taimi e faia i sui tauva taua na fa'ailoaina i vaega ta'itasi, ma o laina ta'itasi e su'esu'eina ta'itasi. E leai se mana'oga e fa'aaoga se SD tutusa.
Ina ia faʻatusatusa taunuuga o lenei suʻesuʻega ma faʻamaumauga ua lolomiina ma faʻatupuina se ata Venn i le Ata 1, na matou tuʻufaʻatasia ai le lisi o porotini faʻatatau ma faʻamatalaga a le MitoCarta 2.0 (24). Faʻaaoga le meafaigaluega i luga ole laiga o le Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) e faʻatupuina ai le ata.
Mo faʻamatalaga auiliili e uiga i faʻagasologa faʻamaufaʻailoga e faʻaaogaina mo le auʻiliʻiliga o le proteomics, faʻamolemole tagaʻi i le vaega talafeagai o Meafaitino ma Metotia. Mo isi faʻataʻitaʻiga uma, e mafai ona maua faʻamatalaga auiliili i le faʻamatalaga talafeagai. Seʻi vagana ua faʻamaonia mai, o faʻamaumauga uma o loʻo faʻaalia o le averesi ± SEM, ma o auʻiliʻiliga faʻamaufaʻailoga uma na faia e faʻaaoga ai le polokalama GraphPad Prism 8.1.2.
Mo nisi fa'amatalaga fa'aopoopo mo lenei tusiga, fa'amolemole taga'i i le http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
O se tusiga e mafai ona maua e tagata uma ma tufatufa atu i lalo o tuutuuga o le Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, lea e faʻatagaina ai le faʻaaogaina, tufatufaina atu ma le toe gaosia i soʻo se auala, pe afai o le faʻaaogaina mulimuli e le mo le manuia faapisinisi ma o le manatu autū o le galuega muamua e saʻo. Faʻasinomaga.
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Saunia e E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
O le suʻesuʻega a le proteomics o neura e le lelei le faʻatinoina na faʻaalia ai o loʻo faʻagaoioia polokalame faʻafomaʻi e teteʻe atu ai i le faʻaleagaina o le neurodegeneration.
Saunia e E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
O le suʻesuʻega a le proteomics o neura e le lelei le faʻatinoina na faʻaalia ai o loʻo faʻagaoioia polokalame faʻafomaʻi e teteʻe atu ai i le faʻaleagaina o le neurodegeneration.
©2020 American Association for the Advance of Science. aia tatau uma ua taofia. AAAS ose paaga a HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ma COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.