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O le propionic acid (PPA) e faʻaaogaina e suʻesuʻe ai le matafaioi o le faʻaletonu o le mitochondrial i faʻalavelave tau atinaʻe o le neura e pei o le autism spectrum disorder. Ua iloa le PPA e faʻalavelaveina le mitochondrial biogenesis, metabolism, ma le turnover. Peitaʻi, o aʻafiaga o le PPA i mitochondrial dynamics, fission ma le fusion o loʻo tumau pea ona faʻafitauli ona o le natura faigata o nei faiga. O iinei, matou te faʻaaogaina metotia faʻaopoopo o ata faʻatusa e suʻesuʻe ai pe faʻapefea ona aʻafia e le PPA le mitochondrial ultrastructure, morphology, ma dynamics i totonu o neuron-like SH-SY5Y cells. O le PPA (5 mM) na mafua ai ona faʻaitiitia tele le mitochondrial area (p < 0.01), Feret diameter ma le circumference (p < 0.05), ma le area 2 (p < 0.01). O le suʻesuʻega o le Mitochondrial event locator na faʻaalia ai se faʻaopoopoga tele (p < 0.05) i fission ma fusion events, ma faʻatumauina ai le tulaga saʻo o le mitochondrial network i lalo o tulaga faigata. E le gata i lea, o le faʻaalia o le mRNA o le cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) ma le OPA1 (p < 0.05) sa matua faʻaitiitia lava. 01). O lenei mea e faʻaalia ai le toe faʻafouina o le morphology o le mitochondrial, biogenesis ma dynamics e faʻatumauina ai le galuega i lalo o tulaga faigata. O a matou faʻamaumauga e maua ai se malamalamaga fou i aafiaga o le PPA i mitochondrial dynamics ma faʻamamafaina ai le aoga o metotia faʻataʻitaʻi mo le suʻesuʻeina o faiga faʻatonutonu faigata e aofia ai i tali atu i le faigata o le mitochondrial.
O Mitochondria o ni vaega taua i le tele o galuega faatino a le sela e sili atu nai lo o latou matafaioi masani i le gaosiga o le malosi ma le biosynthesis. O le metabolism o le Mitochondrial o se fa'atonutonu autu lea o le calcium signaling, metabolic ma redox homeostasis, inflammatory signaling, epigenetic modifications, cell proliferation, differentiation ma le programmed cell death1. Ae maise lava, o le mitochondrial metabolism e taua tele mo le atina'eina o neurons, ola ma le galuega ma e lautele lona a'afia i le tele o fa'aaliga o le neuropathology2,3,4.
I le sefulu tausaga ua tuanaʻi, ua tulaʻi mai le tulaga o le metabolism o se faʻatonutonu tutotonu o le neurogenesis, differentiation, maturation ma le plasticity5,6. Talu ai nei, o le morphology ma le dynamics o mitochondrial ua avea ma vaega taua tele o le mitosis, o se faiga faʻatino e tausia ai se vaitaʻele o mitochondria maloloina i totonu o sela. O le Mitochondrial dynamics e faʻatonutonuina e ala i auala faigata e fesoʻotaʻi e amata mai i le mitochondrial biogenesis ma le bioenergetics i le mitochondrial fission, fusion, transport ma le clearance7,8. O le faʻalavelaveina o soʻo se tasi o nei faiga faʻapipiʻi e faʻalavelaveina ai le tausiga o fesoʻotaʻiga mitochondrial maloloina ma e iai ni taunuuga loloto mo le neurodevelopment9,10. O le mea moni, o le dysregulation o mitochondrial dynamics e matauina i le tele o faʻaletonu o le mafaufau, neurodegenerative ma neurodevelopmental, e aofia ai faʻaletonu o le autism spectrum (ASD)11,12.
O le ASD o se faʻalavelave faʻapitoa o le atinaʻeina o neula ma se fausaga faʻasolopito ma epigenetic faigata. E le finauina le tofi o le ASD, ae o le mafuaʻaga autu o le molecular e le o malamalama lelei i ai. O le faʻaputuina o faʻamaumauga mai faʻataʻitaʻiga preclinical, suʻesuʻega faafomaʻi, ma faʻamaumauga molecular multi-omics e maua ai faʻamaoniga faʻateleina o le faʻaletonu o le mitochondrial i le ASD13,14. Na matou faia muamua se suʻesuʻega o le methylation DNA genome-wide i se vaega o gasegase e iai le ASD ma faʻailoa mai ai genes methylated eseese o loʻo faʻaputuina i luga o auala metabolic mitochondrial15. Na matou lipotia mulimuli ane le methylation eseese o faʻatonutonu tutotonu o le mitochondrial biogenesis ma dynamics, lea na fesoʻotaʻi ma le faʻateleina o le numera o kopi mtDNA ma le suia o le metabolic profile urinary i le ASD16. O a matou faʻamaumauga e maua ai faʻamaoniga faʻateleina o le mitochondrial dynamics ma le homeostasis e iai se sao taua i le pathophysiology o le ASD. O le mea lea, o le faʻaleleia atili o le malamalama faʻapitoa o le sootaga i le va o mitochondrial dynamics, morphology, ma le function o se sini autu o suʻesuʻega faifai pea i faʻamaʻi neurological e faʻailoaina e le faʻaletonu lona lua o le mitochondrial.
E masani ona faʻaaogaina metotia faʻamolekula e suʻesuʻe ai le matafaioi o kenera patino i tali atu i le atuatuvale o le mitochondrial. Peitaʻi, o lenei auala e ono faʻatapulaʻaina e le natura tele ma le taimi o faiga faʻatonutonu mitotic. E le gata i lea, o le faʻaalia eseese o kenera mitochondrial o se faʻailoga e le tuusaʻo o suiga faʻatino, aemaise lava ona e naʻo se numera faʻatapulaʻaina o kenera e masani ona suʻesuʻeina. O le mea lea, ua fautuaina ai ni metotia tuusaʻo mo le suʻesuʻeina o galuega faatino a le mitochondrial ma le bioenergetics17. O le morphology o le mitochondrial e fesoʻotaʻi vavalalata ma le mitochondrial dynamics. O le foliga o le mitochondrial, fesoʻotaʻiga, ma le fausaga e taua tele mo le gaosiga o le malosi ma le ola o le mitochondrial ma le sela5,18. E le gata i lea, o vaega eseese o le mitosis e taulaʻi i suiga i le morphology o le mitochondrial, lea e mafai ona avea o ni faʻaiʻuga aoga o le le lelei o le mitochondrial ma maua ai se faʻavae mo suʻesuʻega faʻatino mulimuli ane.
E mafai ona matauina sa'o le foliga o le Mitochondrial e fa'aaoga ai le transmission electron microscopy (TEM), e mafai ai ona su'esu'e auiliili le ultrastructure o le sela. E fa'aalia sa'o e le TEM le foliga, foliga ma le fausaga o le mitochondrial cristae i le iugafono o mitochondria ta'itasi, nai lo le fa'alagolago na'o le fa'aliliuina o kene, fa'aaliga o polotini po'o fa'asologa o galuega a le mitochondrial i totonu o vaega o sela17,19,20. E le gata i lea, e fa'afaigofieina e le TEM le su'esu'eina o fegalegaleaiga i le va o mitochondria ma isi organelles, e pei o le endoplasmic reticulum ma autophagosomes, lea e faia ni matafaioi taua i le galuega a le mitochondrial ma le homeostasis21,22. O le mea lea, e avea ai le TEM ma amataga lelei mo le su'esu'eina o le fa'aletonu o le mitochondrial a'o le'i taula'i atu i auala fa'apitoa po'o kene. A'o fa'ateleina le taua o le galuega a le mitochondrial i le neuropathology, e manino lava le mana'omia ona mafai ona su'esu'e sa'o ma le aofa'i le foliga ma le malosi o le mitochondrial i fa'ata'ita'iga neuronal in vitro.
I totonu o lenei tusiga, matou te suʻesuʻeina ai le mitochondrial dynamics i se neuronal model o le mitochondrial dysfunction i le autism spectrum disorder. Na matou lipotia muamua le differential methylation o le propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) i le ASD15, o se subunit o le mitochondrial propionyl-CoA carboxylase enzyme PCC. O le dysregulation o le PCC ua iloa e mafua ai le faaputuputuina oona o propionyl derivatives, e aofia ai le propionic acid (PPA)23,24,25. Ua faaalia e le PPA e faalavelaveina ai le metabolism o neuronal ma suia ai amioga i totonu o le tino ma o se faataitaiga manu ua faatuina mo le suesueina o faiga o le neurodevelopmental e aofia ai i le ASD26,27,28. E le gata i lea, ua lipotia mai e le PPA e faalavelaveina ai le mitochondrial membrane potential, biogenesis ma le respiration in vitro ma ua faaaogaina lautele e faataitai ai le mitochondrial dysfunction i neurons29,30. Peitai, o le aafiaga o le PPA-induced mitochondrial dysfunction i luga o le mitochondrial morphology ma dynamics e le o malamalama lelei i ai.
O lenei suʻesuʻega e faʻaaogaina ai metotia faʻataʻitaʻi faʻaopoopo e faʻatatau ai aafiaga o le PPA i luga o le morphology o le mitochondrial, dynamics, ma le galuega i totonu o sela SH-SY5Y. Muamua, na matou atiaʻe se metotia TEM e vaʻaia ai suiga i le morphology ma le ultrastructure o le mitochondrial17,31,32. Ona o le natura faʻagaioiga o le mitochondria33, na matou faʻaaogaina ai foʻi le suʻesuʻega o le mitochondrial event localizer (MEL) e faʻatatau ai suiga i le paleni i le va o le fission ma le fusion events, numera ma le volume o le mitochondrial i lalo o le PPA stress. Mulimuli ane, na matou suʻesuʻeina pe o fesoʻotaʻi le morphology ma le dynamics o le mitochondrial ma suiga i le faʻaalia o genes e aʻafia i le biogenesis, fission, ma le fusion. A tuʻufaʻatasia, o a matou faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai le luʻitau o le faʻamalamalamaina o le lavelave o auala e faʻatonutonu ai le mitochondrial dynamics. Matou te faʻamamafaina le aoga o le TEM i le suʻesuʻeina o le morphology o le mitochondrial o se mea e mafai ona fuaina o le mitosis i sela SH-SY5Y. E le gata i lea, matou te faʻamamafaina o faʻamaumauga TEM e maua ai faʻamatalaga sili ona mauoa pe a tuʻufaʻatasia ma metotia faʻataʻitaʻi e puʻeina ai foʻi mea tutupu faʻagaioiga e tali atu ai i le metabolic stress. O le faʻamatalaina atili o auala faʻatonutonu molecular e lagolagoina ai le neuronal cell mitosis e mafai ona maua ai se malamalamaga taua i le vaega mitochondrial o le nervous system ma faʻamaʻi neurodegenerative.
Ina ia faʻaosofia le atuatuvale o le mitochondrial, na togafitia sela SH-SY5Y i le PPA e faʻaaoga ai le 3 mM ma le 5 mM sodium propionate (NaP). Aʻo leʻi faia le TEM, na faia le sauniuniga o faʻataʻitaʻiga i le cryogenic e faʻaaoga ai le faʻaʻaisa ma le faʻaʻaisa i le mamafa maualuga (Ata 1a). Na matou atiaʻe se paipa faʻatekonolosi o le auʻiliʻiliga o ata mitochondrial e fuaina ai le valu faʻailoga o le morphology o tagata mitochondrial i luga o faʻataʻitaʻiga olaola e tolu. Na matou iloa o le togafitiga PPA na suia tele ai faʻailoga e fa: vaega 2, vaega, perimeter, ma le lautele o le Feret (Ata 1b–e). Na faʻaitiitia tele le vaega 2 i le togafitiga PPA e 3 mM ma le 5 mM (p = 0.0183 ma le p = 0.002, i le faʻasologa) (Ata 1b), ae o le vaega (p = 0.003), perimeter (p = 0.0106) ma le lautele o le Feret ua faʻaitiitia uma. Sa i ai se faʻaitiitiga tele (p = 0.0172) i le vaega togafitiga e 5 mM pe a faʻatusatusa i le vaega pulea (Ata 1c–e). O fa'aitiitiga taua i le lautele ma le li'o na fa'aalia ai o sela na togafitia i le 5 mM PPA e laiti ma sili atu ona lapotopoto mitochondria, ma o nei mitochondria e le umi tele nai lo o lo'o i totonu o sela fa'atonutonu. E ogatasi fo'i lea ma le fa'aitiitiga taua i le lautele o le Feret, o se fa'ailoga tuto'atasi e fa'ailoa mai ai le fa'aitiitiga o le mamao tele i le va o pito o le vaega. Na matauina suiga i le ultrastructure o le cristae: na le toe iloga le cristae i lalo o le faatosinaga o le PPA stress (Ata 1a, panel B). Peita'i, e le'i atagia manino mai e ata uma le ultrastructure o le cristae, o lea e le'i faia ai se su'esu'ega fa'atatau o nei suiga. O nei fa'amaumauga TEM e ono atagia mai ai ni tulaga se tolu e ono tutupu: (1) e fa'aleleia e le PPA le fission pe taofia ai le fusion, ma mafua ai ona fa'aitiitia le tele o mitochondria o lo'o iai; (2) o le fa'aleleia o le biogenesis e fausia ai ni mitochondria fou ma laiti pe (3) fa'aosofia ai faiga uma e lua i le taimi e tasi. E ui lava e le mafai ona iloa nei tulaga e le TEM, o suiga taua i le morphology e fa'ailoa mai ai suiga i le mitochondrial homeostasis ma le dynamics i lalo o le PPA stress. Na matou su'esu'eina mulimuli ane ni fa'ailoga fa'aopoopo e fa'amatala atili ai nei dynamics ma faiga e ono mafua ai.
E toe fa'afouina e le propionic acid (PPA) le foliga o le mitochondrial. (a) Ata o le transmission electron microscopy (TEM) o lo'o fa'aalia ai le fa'aitiitia o le tele o le mitochondrial ma fa'aitiitia ma fa'ata'amilomilo ai mitochondria i le fa'ateleina o le togafitiga PPA; 0 mM (e le'i togafitia), 3 mM ma le 5 mM, i le fa'asologa. O aū mumu e fa'ailoa mai ai mitochondria. (b–e) O sela SH-SY5Y na togafitia i le PPA mo le 24 itula na saunia mo le TEM ma na iloiloina taunuuga e fa'aaoga ai le Fiji/ImageJ. E fa o le valu o parakalafa na fa'aalia ai eseesega taua i le va o sela pulea (e le'i togafitia, 0 mM PPA) ma sela togafitia (3 mM ma le 5 mM PPA). (b) Itumalo 2, (c) Eria, (d) Perimeter, (e) Feret diameter. O le tasi-ala o le su'esu'ega o le eseesega (pulea vs. togafitiga) ma le su'ega fa'atusatusaga tele a Dunnett na fa'aaogaina e iloa ai eseesega taua (p < 0.05). O fa'amaumauga o lo'o fa'atusalia ai le averesi o le tau o le mitochondrial mo sela ta'itasi, ma o pa sese e fa'atusalia ai le averesi ± SEM. O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o lo'o fa'atusalia ai le n = 3, e le itiiti ifo i le 24 sela i le toe faia; e 266 ata na iloiloina; * o lona uiga p < 0.05, ** o lona uiga p < 0.01.
Ina ia fa'amatala atili pe fa'apefea ona tali atu le mitochondrial dynamics i le PPA, na matou valiina le mitochondria i le tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ma fa'aaoga le time-lapse microscopy ma le MEL analysis e iloa ai ma fa'atatauina le mitochondria pe a uma le 24 itula i le 3 ma le 5 mM PPA. Togafitiga o le fission ma le fusion events. (Ata 2a). Ina ua mae'a le MEL analysis, na toe iloiloina le mitochondria e fa'atatauina ai le aofa'i o mitochondrial structures ma lo latou averesi voluma. Na matou matauina se fa'aopoopoga la'ititi ae taua i le aofa'i o fission events na tutupu i le 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] pe a fa'atusatusa i le fission [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] ma le fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ma le fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] na matua fa'ateleina i le 5 mM pe a fa'atusatusa i le vaega fa'atonutonu (Ata 3b). O le aofaʻi o mitochondria na matuā faʻateleina i le 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ma le 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Ata 3c), ae o le averesi o le voluma o fausaga taʻitasi o mitochondrial e leʻi suia (Ata 3c). 3d). A tuʻufaʻatasia, o loʻo faʻaalia ai o le toe faʻaleleia o le mitochondrial dynamics e avea o se tali faʻafetaui e faʻatumauina lelei ai le tulaga saʻo o le fesoʻotaʻiga mitochondrial. O le faʻateleina o le aofaʻi o mea tutupu i le fission i le 3 mM PPA o loʻo faʻaalia ai o le faʻateleina o le numera o mitochondrial e mafua ona o le mitochondrial fission, ae ona o le averesi o le voluma o mitochondrial e tumau pea le le suia, e le mafai ona faʻateʻaina le biogenesis o se tali faʻaopoopo faʻafetaui. Peitaʻi, o nei faʻamaumauga e ogatusa ma fausaga laiti ma lapotopoto o mitochondrial na matauina e le TEM ma faʻaalia ai foʻi suiga taua i le mitochondrial dynamics na mafua mai i le PPA.
O le propionic acid (PPA) e faʻaosofia ai le toe faʻaleleia o le mitochondrial e faʻatumauina ai le saogalemu o le fesoʻotaʻiga. Na faʻatupuina sela SH-SY5Y, togafitia i le 3 ma le 5 mM PPA mo le 24 itula ma valivali i le TMRE ma le Hoechst 33342 ona sosoo ai lea ma le auʻiliʻiliga MEL. (a) Ata faʻatusa o le microscopy time-lapse o loʻo faʻaalia ai le lanu ma faʻaaliga maualuga o le malosi binarized i le taimi 2 (t2) mo tulaga taʻitasi. O vaega filifilia o loʻo faʻaalia i ata binary taʻitasi ua faʻaleleia atili ma faʻaalia i le 3D i taimi eseese e tolu (t1-t3) e faʻaalia ai le gaioiga i le aluga o taimi; o mea tutupu o le fusion ua faʻailoaina i le lanumeamata; o mea tutupu o le fission ua faʻailoaina i le lanumeamata. Faʻaalia i le mumu. (b) Numera averesi o mea tutupu faʻatino i tulaga taʻitasi. (c) Numera averesi o fausaga mitochondrial i le sela. (d) Voluma averesi (µm3) o fausaga mitochondrial taʻitasi i le sela. O faʻamatalaga o loʻo faʻaalia o loʻo faʻatusalia ai le n = 15 sela i le vaega togafitiga. O pa sese o loʻo faʻaalia o loʻo faʻatusalia ai le averesi ± SEM, pa fua = 10 μm, * p < 0.05.
O le propionic acid (PPA) e mafua ai le taofiofia o le fa'aliliuga o kene e feso'ota'i ma le mitochondrial dynamics. O sela SH-SY5Y na togafitia i le 3 ma le 5 mM PPA mo le 24 itula. O le fa'atusatusaga o kene na faia e fa'aaoga ai le RT-qPCR ma fa'atulagaina i le B2M. Mitochondrial biogenesis genes (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ma le (d) NFE2L2. Mitochondrial fusion ma fission genes (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ma le (i) DRP1. O eseesega taua (p < 0.05) na tofotofoina e fa'aaoga ai le tasi-ala ANOVA (pulea vs. togafitiga) ma le Dunnett's multiple comparison test: * e fa'ailoa mai ai le p < 0.05, ** e fa'ailoa mai ai le p < 0.01, ma **** e fa'ailoa mai ai le p < 0.0001. O pa e fa'atusalia ai le averesi o le fa'aaliga ± SEM. O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia o loʻo faʻatusalia ai le n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), ma le n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) o faʻataʻitaʻiga faʻaola.
O faʻamaumauga mai le auʻiliʻiliga a le TEM ma le MEL e faʻaalia ai o le PPA e suia ai le foliga ma le malosi o le mitochondrial. Peitaʻi, o nei metotia faʻataʻitaʻi e le maua ai se malamalamaaga i auala autu e faʻatautaia ai nei faiga. O le mea lea na matou suʻesuʻeina ai le faʻaalia o le mRNA o le iva o tulafono faʻatonutonu autu o le mitochondrial dynamics, biogenesis, ma le mitosis e tali atu ai i togafitiga PPA. Na matou fuaina le cell myeloma oncogene (cMYC), nuclear respiratory factor (NRF1), mitochondrial transcription factor 1 (TFAM), NFE2-like transcription factor BZIP (NFE2L2), gastrin-like protein 2 (STOML2), optic nerve atrophy 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) ma le dynamin-related protein 1 (DRP1) ina ua maeʻa le 24 itula o togafitiga ma le 3 mM ma le 5 mM PPA. Na matou matauina le 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 ma le p < 0.0001, i le faasologa) ma le 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) togafitiga PPA. (Ata 3a–c). O le faaitiitia o le faaaliga o le mRNA sa faalagolago i le fualaau: o le faaaliga o le cMYC, NRF1 ma le TFAM na faaitiitia i le 5.7, 2.6 ma le 1.9 taimi i le 3 mM, i le faasologa, ma le 11.2, 3 ma le 2.2 taimi i le 5 mM. I se faatusatusaga, o le kene autu o le redox biogenesis NFE2L2 e lei suia i soo se tulaga maualuga o le PPA, e ui lava o se aga tutusa o le faaitiitia o le faaaliga na matauina (Ata 3d).
Na matou suʻesuʻeina foʻi le faʻaalia o kenera masani e aʻafia i le faʻatonutonuina o le fission ma le fusion. E manatu o le STOML2 e aʻafia i le fusion, mitophagy ma le biogenesis, ma o lona faʻaalia na matua faʻaitiitia (p < 0.0001) i le 3 mM (suiga 2.4-fold) ma le 5 mM (suiga 2.8-fold) PPA (Ata 1). 3d). I se tulaga tutusa, o le faʻaalia o le kenera OPA1 fusion na faʻaitiitia i le 3 mM (suiga 1.6-fold) ma le 5 mM (suiga 1.9-fold) PPA (p = 0.006 ma le p = 0.0024, i le faʻasologa) (Ata 3f). Peitaʻi, matou te leʻi mauaina ni eseesega taua i le faʻaalia o kenera fusion MFN1, MFN2 poʻo le kenera fission DRP1 i lalo o le 24-itula o le PPA stress (Ata 3g–i). E le gata i lea, na matou iloa ai o le maualuga o porotini e fa o le fusion ma le fission (OPA1, MFN1, MFN2 ma le DRP1) e le'i suia i lalo o tulaga tutusa (Ata 4a–d). E taua le maitauina o nei fa'amaumauga e atagia mai ai se taimi e tasi ma atonu e le atagia ai suiga i le fa'aalia o porotini po'o le maualuga o gaioiga i le taimi muamua o le fa'alavelave PPA. Peita'i, o le fa'aitiitia tele o le fa'aalia o le cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ma le OPA1 e fa'aalia ai le fa'aletonu tele o le fa'aliliuga o le metabolism o le mitochondrial, biogenesis, ma le dynamics. E le gata i lea, o nei fa'amaumauga e fa'amamafa ai le aoga o metotia fa'ata'ita'i e su'esu'e sa'o ai suiga o le tulaga i'uga i le galuega a le mitochondrial.
E le'i suia le maualuga o le porotini o le fusion ma le fission factor ina ua mae'a togafitiga o le propionic acid (PPA). O sela SH-SY5Y na togafitia i le 3 ma le 5 mM PPA mo le 24 itula. O le maualuga o le porotini na fuaina e ala i le au'ili'iliga o le Western blot, ma o le maualuga o le fa'aalia na fa'atulagaina i le porotini atoa. O lo'o fa'aalia le averesi o le fa'aalia o le porotini ma le Western blots fa'atusa o le porotini fa'atatau ma le porotini atoa. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. O pa e fa'atusalia ai le averesi ± SEM, ma o fa'amaumauga o lo'o fa'aalia o lo'o fa'atusalia ai le n = 3 biological replicates. O fa'atusatusaga e tele (p < 0.05) na faia e fa'aaoga ai le au'ili'iliga o le eseesega i le itu e tasi ma le su'ega a Dunnett. O le gel muamua ma le blot o lo'o fa'aalia i le Ata S1.
O le faaletonu o le Mitochondrial e fesoʻotaʻi ma faʻamaʻi o le tele o faiga e amata mai i faʻamaʻi o le metabolism, cardiovascular ma muscular i faʻamaʻi o neura1,10. O le tele o faʻamaʻi neurodegenerative ma neurodegenerative e fesoʻotaʻi ma le faaletonu o le mitochondrial, ma faʻamamafaina ai le taua o nei organelles i le olaga atoa o le faiʻai. O nei faʻamaʻi e aofia ai le faʻamaʻi o Parkinson, le faʻamaʻi o Alzheimer ma le ASD3,4,18. Peitaʻi, o le avanoa i aano o le faiʻai e suʻesuʻe ai nei faʻamaʻi e faigata, aemaise lava i le tulaga faʻamasini, ma avea ai faiga faʻataʻitaʻiga sela o se isi mea e manaʻomia. I lenei suʻesuʻega, matou te faʻaaogaina se faiga faʻataʻitaʻiga sela e faʻaaogaina ai sela SH-SY5Y ua togafitia i le PPA e toe faʻafoʻi mai ai le faaletonu o le mitochondrial na matauina i faʻamaʻi o neuronal, aemaise lava faʻaletonu o le autism spectrum. O le faʻaaogaina o lenei faʻataʻitaʻiga PPA e suʻesuʻe ai le mitochondrial dynamics i neurons e mafai ona maua ai se malamalamaaga i le mafuaʻaga o le ASD.
Na matou suʻesuʻeina le avanoa e faʻaaoga ai le TEM e vaʻai ai i suiga i le foliga o le mitochondrial. E taua le maitauina e tatau ona faʻaaoga saʻo le TEM ina ia faʻateleina lona aoga. O le sauniaina o faʻataʻitaʻiga cryo e mafai ai ona faʻasaoina lelei fausaga o neuronal e ala i le faʻapipiʻiina o vaega o le sela ma faʻaitiitia ai le fausiaina o mea totino34. E ogatasi ma lenei mea, na matou matauina o sela SH-SY5Y e pei o neuron e iai ni organelles subcellular e leʻi afaina ma mitochondria faʻaloloa (Ata 1a). O lenei mea e faʻamamafa ai le aoga o metotia sauniuniga cryogenic mo le suʻesuʻeina o le foliga o le mitochondrial i faʻataʻitaʻiga o sela neuronal. E ui o fuataga faʻatatau e taua tele mo le auʻiliʻiliga faʻapitoa o faʻamatalaga TEM, ae e leai lava se maliliega i po o a faʻailoga patino e tatau ona fuaina e faʻamaonia ai suiga faʻatatau o le mitochondrial. E faʻavae i luga o le tele o suʻesuʻega na suʻesuʻeina faʻatatau le foliga o le mitochondrial17,31,32, na matou atiaʻe ai se paipa auʻiliʻiliga ata mitochondrial otometi e fuaina ai faʻailoga e valu, e pei o: eria, eria2, aspect ratio, perimeter, circularity, degree , Feret diameter. ma le roundness.
I totonu o na mea, na faʻaitiitia tele e le PPA le vaega 2, le vaega, le perimeter, ma le lautele o le Feret (Ata 1b–e). O lenei mea na faʻaalia ai na faʻaitiitia ma faʻataʻamilomilo le mitochondria, lea e ogatasi ma suʻesuʻega na faia muamua o loʻo faʻaalia ai le faʻaitiitia o le vaega o le mitochondrial ina ua mavae le 72 itula o le faʻalavelave faʻafuaseʻi o le mitochondrial e mafua mai i le PPA30. O nei foliga faʻapitoa e ono faʻaalia ai le mitochondrial fission, o se faiga e manaʻomia e aveese ai vaega ua faʻaleagaina mai le fesoʻotaʻiga mitochondrial e faʻalauiloa ai lo latou faʻaleagaina e ala i le mitophagy35,36,37. I le isi itu, o le faʻaitiitia o le averesi o le tele o le mitochondrial atonu e fesoʻotaʻi ma le faʻateleina o le biogenesis, lea e mafua ai le fausiaina o mitochondria laiti nascent. O le faʻateleina o le fission poʻo le biogenesis o loʻo faʻatusalia ai se tali faʻafetaui e faʻatumauina ai le mitosis e faʻasaga i le faʻalavelave faʻafuaseʻi o le mitochondrial. Peitaʻi, e le mafai ona tuʻua le faʻaitiitia o le tuputupu aʻe o le mitochondrial, le faʻaleagaina o le fusion, poʻo isi tulaga.
E ui o ata maualuluga na fatuina e le TEM e mafai ai ona fuafuaina uiga fa'aletino i le tulaga o mitochondria ta'itasi, o lenei metotia e maua ai ni ata pu'upu'u e lua-vaega i le taimi e tasi. Mo le su'esu'eina o tali fa'atino i le atuatuvale o le metabolism, na matou valiina mitochondria i le TMRE ma fa'aaoga le time-lapse microscopy ma le au'ili'iliga MEL, lea e mafai ai ona fa'aalia manino le 3D o suiga i le feso'ota'iga mitochondrial i le aluga o taimi33,38. Na matou matauina ni suiga laiti ae taua i le malosi o le mitochondrial i lalo o le atuatuvale o le PPA (Ata 2). I le 3 mM, na fa'ateleina tele le aofa'i o mea na tutupu i le fission, a'o tumau pea mea na tutupu i le fusion e pei o le pulea. O se fa'aopoopoga i le aofa'i o mea na tutupu i le fission ma le fusion na matauina i le 5 mM PPA, ae o nei suiga e tutusa lelei, ma fa'ailoa mai ai o le fission ma le fusion kinetics e o'o atu i le paleni i tulaga maualuga (Ata 2b). O le averesi o le mitochondrial volume na tumau pea e le'i suia i le 3 ma le 5 mM PPA, e fa'ailoa mai ai o le fa'amaoni o le feso'ota'iga mitochondrial na fa'asaoina (Ata 2d). O lenei mea e atagia ai le gafatia o feso'ota'iga mitochondrial fa'atino e tali atu ai i le atuatuvale o le metabolism e tausia lelei ai le homeostasis e aunoa ma le mafua ai ona vaeluaina le feso'ota'iga. I le 3 mM PPA, o le faʻateleina o le fission e lava lea e faʻalauiloa ai le suiga i se paleni fou, ae e manaʻomia se toe faʻaleleia atili o le kinetic e tali atu ai i le atuatuvale e mafua mai i le maualuga o le PPA.
Sa faʻateleina le aofaʻi o mitochondria i tulaga uma e lua o le PPA stress, ae o le averesi o le mitochondrial volume e leʻi suia tele (Ata 2c). Atonu e mafua lenei mea i le faʻateleina o le biogenesis poʻo le faʻateleina o le vaeluaga; peitaʻi, i le leai o se faʻaitiitia tele o le averesi o le mitochondrial volume, e sili atu le foliga mai o le biosynthesis e faʻateleina. Peitaʻi, o faʻamatalaga i le Ata 2 e lagolagoina ai le i ai o ni auala e lua e faʻafetaui ai: o le faʻateleina o le aofaʻi o mea tutupu i le fission, e ogatasi ma le faʻateleina o le mitochondrial fission, ma le faʻateleina o le aofaʻi o mea tutupu, e ogatasi ma le mitochondrial biogenesis. I le iuga, o le taui faʻatino mo le mamafa vaivai e ono aofia ai ni faiga faʻatasi e aofia ai le fission, fusion, biogenesis, ma le mitophagy. E ui ina ua faʻaalia e tusitala muamua o le PPA e faʻaleleia atili ai le mitosis30,39 ma le mitophagy29, matou te tuʻuina atu faʻamaoniga mo le toe faʻaleleia o le mitochondrial fission ma le fusion dynamics e tali atu ai i le PPA. O nei faʻamatalaga e faʻamaonia ai suiga o le morphology na matauina e le TEM ma tuʻuina atu ai nisi malamalamaga i auala e fesoʻotaʻi ma le PPA-induced mitochondrial dysfunction.
Ona e le'i tu'uina mai e le au'ili'iliga a le TEM po'o le MEL ni fa'amaoniga tu'usa'o o faiga fa'atonutonu o kene o lo'o i lalo o suiga fa'aletino na matauina, na matou su'esu'eina ai le fa'aalia o le RNA o kene o lo'o a'afia i le metabolism o le mitochondrial, biogenesis, ma le dynamics. O le cMYC proto-oncogene o se transcription factor e a'afia i le fa'atonutonuina o le mitochondria, glycolysis, amino acid ma le fatty acid metabolism40. E le gata i lea, ua iloa le cMYC e fa'atonutonuina le fa'aalia o le toeitiiti atoa le 600 mitochondrial genes e a'afia i le mitochondrial transcription, translation, ma le complex assembly, e aofia ai le NRF1 ma le TFAM41. O le NRF1 ma le TFAM o ni fa'atonutonu tutotonu e lua o le mitosis, e galue i lalo ifo o le PGC-1α e fa'agaoioia ai le mtDNA replication. O lenei auala e fa'agaoioia e le cAMP ma le AMPK signaling ma e maaleale i le fa'aaluina o le malosi ma le metabolic stress. Na matou su'esu'eina fo'i le NFE2L2, o se redox regulator o le mitochondrial biogenesis, e iloa ai pe ono fa'alavelaveina aafiaga o le PPA e le oxidative stress.
E ui lava ina tumau pea le le suia o le fa'aalia o le NFE2L2, ae na matou maua se fa'aitiitia faifai pea o le fa'aalia o le cMYC, NRF1 ma le TFAM ina ua mavae le 24 itula o togafitiga ma le 3 mM ma le 5 mM PPA (Ata 3a–c). O le fa'aitiitia o le fa'aalia o le cMYC na lipotia muamua o se tali atu i le atuatuvale o le mitochondrial42, ma i se isi itu, o le fa'aitiitia o le fa'aalia o le cMYC e mafai ona mafua ai le le lelei o le mitochondrial e ala i le toe fa'afouina o le metabolism o le mitochondrial, feso'ota'iga feso'ota'iga, ma le polarization o le membrane43. O le mea e malie ai, o lo'o a'afia fo'i le cMYC i le fa'atonutonuina o le mitochondrial fission ma le fusion42,43 ma ua iloa e fa'ateleina ai le DRP1 phosphorylation ma le mitochondrial localization i le taimi o le vaeluaga o le sela44, fa'apea fo'i ma le fa'atonutonuina o le toe fa'afouina o le mitochondrial i totonu o neuronal stem cells45. O le mea moni, o le cMYC-deficient fibroblasts e fa'aalia ai le fa'aitiitia o le tele o le mitochondrial, e ogatasi ma suiga na mafua mai i le atuatuvale o le PPA43. O nei fa'amaumauga o lo'o fa'aalia ai se sootaga manaia ae le o manino i le va o le cMYC ma le mitochondrial dynamics, ma maua ai se sini manaia mo su'esu'ega i le lumana'i o le toe fa'afouina o le PPA e mafua mai i le atuatuvale.
O le fa'aitiitia o le NRF1 ma le TFAM e ogatasi ma le matafaioi a le cMYC o se fa'agaoioiga taua o le fa'aliliuga. O nei fa'amaumauga e ogatasi fo'i ma su'esu'ega na faia muamua i sela o le kanesa o le kolone o le tagata o lo'o fa'aalia ai na fa'aitiitia e le PPA le fa'aalia o le NRF1 mRNA i le 22 itula, lea na feso'ota'i ma le fa'aitiitia o le ATP ma fa'ateleina ai le ROS46. Na lipotia mai fo'i e nei tusitala na fa'ateleina le fa'aalia o le TFAM i le 8.5 itula ae na toe fo'i i tulaga masani i le 22 itula. I se fa'atusatusaga, na fa'aalia ai e Kim et al. (2019) na matua fa'aitiitia le fa'aalia o le TFAM mRNA ina ua mavae le 4 itula o le fa'alavelave PPA i sela SH-SY5Y; peita'i, ina ua mavae le 72 itula, na matua fa'ateleina le fa'aalia o le porotini TFAM ma na matua fa'ateleina le numera o kopi mtDNA. O le mea lea, o le fa'aitiitia o le aofa'i o genes o le mitochondrial biogenesis na matou matauina ina ua mavae le 24 itula e le fa'ate'aina ai le avanoa e fa'apea o le fa'ateleina o le aofa'i o mitochondria e feso'ota'i ma le fa'agaoioiga o le biogenesis i taimi muamua. O suʻesuʻega ua mavae ua faʻaalia ai o le PPA e faʻateleina tele ai le PGC-1α mRNA ma le porotini i totonu o sela SH-SY5Y i le 4 itula ma le 30 minute, aʻo faʻaleleia e le propionic acid le mitochondrial biogenesis i totonu o hepatocytes o tamaʻi povi e ala i le PGC-1α i le 12 itula ma le 39 minute. O le mea e malie ai, o le PGC-1α e le gata o se faʻatonutonu tuusaʻo o le transcriptional o le NRF1 ma le TFAM, ae ua faʻaalia foʻi e faʻatonutonuina le gaioiga a le MFN2 ma le DRP1 e ala i le faʻatonutonuina o le fission ma le fusion47. A tuʻufaʻatasia, o lenei mea e faʻamamafaina ai le vavalalata o faiga e faʻatonutonuina ai tali tauia o mitochondrial e mafua mai i le PPA. E le gata i lea, o a matou faʻamaumauga e atagia mai ai le tele o le le faʻatonutonuina o le transcriptional regulation o le biogenesis ma le metabolism i lalo o le PPA stress.
O kene STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ma le DRP1 o nisi ia o pulega autu o le mitochondrial fission, fusion ma dynamics37,48,49. E tele isi kene e aofia ai i le mitochondrial dynamics, peitaʻi, o le STOML2, OPA1 ma le MFN2 ua maua muamua o loʻo eseese le methylation i totonu o vaega o le ASD,16 ma o le tele o suʻesuʻega tutoʻatasi ua lipotia mai ai suiga i nei transcription factors e tali atu ai i le mitochondrial stress50,51. 52. O le faʻaalia o le OPA1 ma le STOML2 na matua faʻaitiitia i le 3 mM ma le 5 mM PPA treatment (Ata 3e, f). O le OPA1 o se tasi o pulega masani o le mitochondrial fusion e ala i le fegalegaleaiga tuusaʻo ma le MFN1 ma le 2 ma e iai sona sao i le toe faʻaleleia o le cristae ma le mitochondrial morphology53. O le sao tonu o le STOML2 i le mitochondrial dynamics e le o manino, ae o faʻamaoniga e faʻaalia ai e iai sona sao i le mitochondrial fusion, biogenesis, ma le mitophagy.
O lo'o a'afia le STOML2 i le fa'atumauina o le fa'apipi'iina o le manava o le mitochondrial ma le fausiaina o le respiratory chain complexes54,55 ma ua fa'aalia e suia tele ai uiga o le metabolism o sela o le kanesa56. Ua fa'aalia i su'esu'ega e fa'alauiloa e le STOML2 le gafatia o le membrane mitochondrial ma le biogenesis e ala i le fegalegaleai ma le BAN ma le cardiolipin55, 57, 58. E le gata i lea, o su'esu'ega tuto'atasi ua fa'aalia ai o le fegalegaleaiga i le va o le STOML2 ma le PINK1 e fa'atonutonuina ai le mitophagy59,60. E taua tele, ua lipotia mai o le STOML2 e fegalegaleai sa'o ma fa'amautu le MFN2 ma e iai fo'i sona sao taua i le fa'amautu o isoforms uumi o le OPA1 e ala i le taofia o le protease e nafa ma le fa'aleagaina o le OPA153,61,62. O le fa'aitiitia o le fa'aalia o le STOML2 e matauina i tali a le PPA e ono fa'afaigofie ai nei porotini fa'afefiloi i le fa'aleagaina e ala i auala e fa'alagolago i le ubiquitin ma le proteasome48. E ui e le o manino le matafaioi tonu a STOML2 ma le OPA1 i le tali atu fa'aolaola i le PPA, o le fa'aitiitia o le fa'aalia o nei kenera fa'afefiloi (Ata 3) e ono fa'alavelaveina ai le paleni i le va o le fission ma le fusion ma mafua ai ona fa'aitiitia le tele o mitochondrial (Ata 3). 1).
I le isi itu, o le fa'aalia o le porotini OPA1 e le'i suia pe a mavae le 24 itula, ae o le mRNA ma le maualuga o le porotini o le MFN1, MFN2 po'o le DRP1 e le'i suia tele pe a uma le togafitiga PPA (Ata 3g-i, Ata 4). Atonu e fa'ailoa mai ai e leai ni suiga i le fa'atonutonuina o nei mea e a'afia i le mitochondrial fusion ma le fission. Peita'i, e taua le maitauina o nei genes ta'itasi e fa e fa'atonutonuina fo'i e ala i fa'asa'oga posttranscriptional (PTMs) e pulea ai le gaioiga o porotini. O le OPA1 e valu isi suiga o le splice e vaeluaina fa'aproteolytically i totonu o mitochondria e gaosia ai ni isoforms se lua eseese 63. O le paleni i le va o isoforms uumi ma pupuu e iu lava ina fuafua ai le matafaioi a le OPA1 i le mitochondrial fusion ma le tausiga o le mitochondrial network64. O le gaioiga a le DRP1 e fa'atonutonuina e le calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) phosphorylation, ae o le fa'aleagaina o le DRP1 e fa'atonutonuina e le ubiquitination ma le SUMOylation65. Ma le mea mulimuli, o le DRP1 ma le MFN1/2 o GTPases, o lea e ono aʻafia ai le gaioiga e le fua faatatau o le gaosiga o le GTP i mitochondria 66. O le mea lea, e ui lava o le faʻaalia o nei porotini e tumau pea, ae atonu e le o atagia ai le gaioiga o porotini e le suia poʻo le localization67,68. O le mea moni, o loʻo iai nei PTM protein repertoires e masani ona avea ma laina muamua o le puipuiga e nafa ma le faʻatalanoaina o tali faʻafuaseʻi o le atuatuvale. I le iai o le atuatuvale metabolic feololo i la matou faʻataʻitaʻiga, e foliga mai o le PTM e faʻalauiloa le faʻateleina o le gaioiga o le fusion ma le fission proteins e toe faʻafoʻisia ai le malosi o le mitochondrial e aunoa ma le manaʻomia o le faʻagaoioia faʻaopoopo o nei genes i le mRNA poʻo le tulaga o le porotini.
A tuufaatasia, o faʻamaumauga o loʻo i luga o loʻo faʻamamafaina ai le faʻatonutonuina faigata ma le faʻalagolago i le taimi o le morphology o mitochondrial ma luʻitau o le faʻamalamalamaina o nei faiga. Mo le suʻesuʻeina o le faʻaalia o kene, e tatau muamua ona faʻailoa ni kene faʻapitoa i le auala. Peitaʻi, o a matou faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai o kene i le auala lava e tasi e le tali atu i le auala lava e tasi i le atuatuvale tutusa. O le mea moni, o suʻesuʻega na faia muamua na faʻaalia ai o kene eseese i le auala lava e tasi e ono faʻaalia ai ni faʻamatalaga tali eseese i le taimi30,46. E le gata i lea, o loʻo i ai ni faiga faigata pe a uma le faʻaliliuga e faʻalavelaveina ai le sootaga i le va o le faʻaliliuga ma le galuega a kene. O suʻesuʻega proteomic e mafai ona maua ai se malamalamaaga i le aʻafiaga o PTM ma le galuega a porotini, ae latou te tuʻuina atu foʻi ni luʻitau e aofia ai metotia maualalo, fua faatatau maualuga o le signal-to-noise, ma le le lelei o le iugafono.
I lenei tulaga, o le suʻesuʻeina o le morphology o le mitochondrial e faʻaaoga ai le TEM ma le MEL e tele lona gafatia e taliina ai fesili taua e uiga i le sootaga i le va o le mitochondrial dynamics ma le galuega faatino ma le auala e aʻafia ai faʻamaʻi. O le mea e sili ona taua, o le TEM e maua ai se metotia tuusaʻo mo le fuaina o le morphology o le mitochondrial o se faʻaiʻuga e faʻatasi ai le faʻaletonu ma le faʻagaioiga o le mitochondrial51. E maua ai foʻi e le MEL se metotia tuusaʻo mo le vaʻaia o mea tutupu o le fission ma le fusion i se siosiomaga e tolu-dimensional cellular, e mafai ai ona fuaina le toe faʻaleleia o le mitochondrial dynamic e tusa lava pe leai ni suiga i le faʻaalia o gene33. O iinei matou te faʻamamafaina ai le aoga o metotia faʻataʻitaʻi mitochondrial i faʻamaʻi lona lua o le mitochondrial. O nei faʻamaʻi e masani ona faʻailoaina e le faʻalavelave faʻasolosolo vaivai o le metabolic e faʻailoaina e le toe faʻaleleia maaleale o fesoʻotaʻiga mitochondrial nai lo le faʻaleagaina faʻafuaseʻi o le mitochondrial. Peitaʻi, o le taui o le mitochondrial e manaʻomia e faʻatumauina ai le mitosis i lalo o le faʻalavelave tumau e iai ni taunuuga loloto o galuega faatino. I le tulaga o le neuroscience, o se malamalama sili atu i nei faiga taui e mafai ona maua ai faʻamatalaga taua e uiga i le pleiotropic neuropathology e fesoʻotaʻi ma le faʻaletonu o le mitochondrial.
I le iuga, o a matou faʻamaumauga e faʻamamafa ai le aoga o metotia faʻataʻitaʻi mo le malamalama i taunuuga faʻatino o fegalegaleaiga faigata i le va o le faʻaalia o kene, suiga o porotini, ma gaioiga o porotini e pulea ai le neuronal mitochondrial dynamics. Na matou faʻaaogaina le PPA e faʻataʻitaʻi ai le faʻaletonu o le mitochondrial i se faʻataʻitaʻiga o le neuronal cell e maua ai se malamalamaaga i le vaega mitochondrial o le ASD. O sela SH-SY5Y na togafitia i le PPA na faʻaalia ai suiga i le morphology o le mitochondrial: na laiti ma lapotopoto le mitochondria, ma na le lelei le faʻamatalaina o cristae pe a matauina e le TEM. O le suʻesuʻega a le MEL e faʻaalia ai o nei suiga e tutupu faʻatasi ma le faʻateleina o mea tutupu o le fission ma le fusion e faʻatumauina ai le fesoʻotaʻiga mitochondrial e tali atu ai i le mamafa o le metabolic. E le gata i lea, o le PPA e faʻalavelaveina tele ai le faʻatonutonuina o le transcriptional o le metabolism ma le homeostasis o le mitochondrial. Na matou faʻailoaina le cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, ma le OPA1 o ni faʻatonutonu autu o le mitochondrial na faʻalavelaveina e le popolega o le PPA ma atonu e iai se sao i le faʻatalanoaina o suiga na mafua mai i le PPA i le morphology ma le galuega a le mitochondrial. E manaʻomia suʻesuʻega i le lumanaʻi e faʻamatalaina atili ai suiga faʻafuaseʻi na mafua mai i le PPA i le faʻaalia o kene ma le gaioiga o porotini, localization, ma suiga pe a uma le faʻaliliuga. O a matou faʻamaumauga o loʻo faʻamamafaina ai le lavelave ma le fefaʻalagolagomaʻi o faiga faʻatonutonu o loʻo faʻatautaia ai le tali atu i le atuatuvale o le mitochondrial ma faʻaalia ai le aoga o le TEM ma isi metotia faʻataʻitaʻi mo suʻesuʻega faʻapitoa faʻapitoa.
O le laina o sela SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) na faʻatau mai Sigma-Aldrich. Na totoina sela SH-SY5Y i le Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 nutrient mixture (DMEM/F-12) ma le L-glutamine (SC09411, ScienCell) i totonu o fagu e 25 cm2 ua faʻaopoopo i ai le 20% fetal bovine serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ma le 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) i le 37 °C, 5% CO2. Na totoina sela i lalo i le 80% o le faʻafefiloi e faʻaaoga ai le 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), faʻacentrifuge i le 300 g ma faʻapipiʻi i le mafiafia e tusa ma le 7 × 105 sela/ml. O fa'ata'ita'iga uma sa faia i luga o sela SH-SY5Y e le'i fa'avasegaina i le va o vaega 19–22. O le PPA e tu'uina atu o le NaP. Fa'afefiloi le pa'u NaP (CAS No. 137-40-6, fua fa'akemikolo C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) i le vai mafanafana o le MilliQ i le maualuga o le 1 M ma teu i le 4 °C. I le aso o le togafitiga, fa'afefiloi lenei vaila'au i le 1 M PPA i le 3 mM ma le 5 mM PPA i le vaila'au e leai se serum (DMEM/F-12 ma le L-glutamine). O le maualuga o togafitiga mo fa'ata'ita'iga uma e leai se PPA (0 mM, pulea), 3 mM, ma le 5 mM PPA. O fa'ata'ita'iga sa faia i le itiiti ifo ma le tolu fa'ata'ita'iga fa'aola.
Sa totoina sela SH-SY5Y i totonu o fagu e 25 cm5 i le fua faatatau o le 5.5 × 105 sela/ml ma totoina mo le 24 itula. Sa faaopoopo le togafitiga PPA i totonu o le fagu a’o le’i oo i le 24 itula o le fa’asusuina. Aoina pellets sela e mulimuli i faiga masani o le totoina o aano o manufasi (o lo’o fa’amatalaina i luga). Toe fa’asusu le pellet sela i le 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS ma teu i le 4 °C se’ia o’o i le taimi e fa’agasolo ai. Sa fa’asolo pu’upu’u sela SH-SY5Y e fa’asusu ai sela ma aveese le 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS solution. Toe fa’asusu le palapala i totonu o le 4% agarose gel ua saunia i le vai fa’amamāina (o le fua faatatau o le agarose i le voluma o le palapala e 1:1). Sa tuu fasi agarose i luga o grids i luga o ipu mafolafola ma ufiufi i le 1-hexadecene a’o le’i fa’a’aisa i le mamafa maualuga. Sa fa’a’aisa fa’ata’ita’iga i le 100% acetone mago i le -90°C mo le 24 itula. Ona siitia lea o le vevela i le -80°C ma faaopoopo i ai se vailaau o le 1% osmium tetroxide ma le 0.1% glutaraldehyde. Sa teuina faataitaiga i le -80°C mo le 24 itula. A maeʻa lenei mea, ona faasolosolo malie lea ona siitia le vevela i le vevela o le potu i ni nai aso: mai le –80 °C i le –50 °C mo le 24 itula, i le –30 °C mo le 24 itula, i le –10 °C mo le 24 itula ma mulimuli ane i le vevela o le potu.
A maeʻa le sauniuniga o le cryogenic, sa faʻasusuina faʻataʻitaʻiga i le resin ma faia ni vaega manifinifi (∼100 nm) e faʻaaoga ai le Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems). Sa valiina vaega i le 2% uranyl acetate ma le lead citrate. Sa matauina faʻataʻitaʻiga e faʻaaoga ai le FEI Tecnai 20 transmission electron microscope (ThermoFisher (sa taʻua muamua o le FEI), Eindhoven, Netherlands) o loʻo faʻagaoioia i le 200 kV (Lab6 transmitter) ma se meapueata Gatan CCD (Gatan, UK) ua faʻapipiʻiina i se Tridiem energy filter.
I fa'ata'ita'iga fa'atekinolosi ta'itasi, e le itiiti ifo ma le 24 ata o sela ta'itasi na maua, mo le aofa'i o ata e 266. O ata uma na su'esu'eina e fa'aaoga ai le Region of Interest (ROI) macro ma le Mitochondria macro. O le mitochondrial macro e fa'avae i luga o metotia ua lolomiina17,31,32 ma e mafai ai ona fa'agasologa fa'atasi o ata TEM i Fiji/ImageJ69. I se aotelega: o le ata e fa'aliliuina ma fa'aliliuina e fa'aaoga ai le fa'aitiitia o le polo ta'avale (60 pixel radius) ma se FFT bandpass filter (e fa'aaoga ai le 60 ma le 8 pixel pito i luga ma lalo) ma le taofia o laina fa'atulagaina ma le fa'atagaina o le orientation o le 5%. O le ata ua fa'agasoloina e otometi lava ona fa'atapula'aina e fa'aaoga ai se algorithm entropy maualuga ma faia ai se binary mask. O vaega o ata e feso'ota'i ma ROI ua filifilia e le lima i ata TEM mata na aveeseina, e fa'ailoa ai mitochondria ma e le aofia ai le membrane plasma ma isi vaega e maualuga le eseesega. Mo ROI taʻitasi na faʻaosoina, o vaega binary e sili atu i le 600 pixels na iloiloina, ma o le lautele o le vaega, le perimeter, major ma minor axes, Feret diameter, roundness, ma le circularity na fuaina e faʻaaoga ai galuega faʻatino o le fuaina o le Fiji/ImageJ. I le mulimuli ai ia Merrill, Flippo, ma Strack (2017), o le area 2, particle aspect ratio (major to minor axis ratio), ma le shape factor (FF) na fuafuaina mai nei faʻamaumauga, lea o le FF = perimeter 2/4pi x area. O le faʻamatalaga o le parametric formula e mafai ona maua i le Merrill, Flippo, ma Strack (2017). O macros o loʻo taʻua o loʻo maua i le GitHub (tagai i le Data Availability Statement). I le averesi, e tusa ma le 5,600 vaega na iloiloina i togafitiga taʻitasi a le PPA, mo le aofaʻi e tusa ma le 17,000 vaega (e leʻi faʻaalia faʻamaumauga).
Sa tuu sela SH-SH5Y i totonu o ipu fa'atupuina e 8-potu (ThermoFisher, #155411) ina ia mafai ai ona pipii i le po atoa ona fa'asusu lea i le TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ma le Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). valivali. Sa maua ata e fa'aaoga ai le 405 nm ma le 561 nm lasers i se siosiomaga e 10 minute, ma sa maua ata mata o ni z-stacks o lo'o i ai ata maikolope e 10 ma le la'asaga az o le 0.2 μm i le va o fa'avaa ata i le 12 taimi mulimuli ane. Sa aoina ata e fa'aaoga ai le Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-resolution platform (Carl Zeiss, Oberkochen, Siamani) e fa'aaoga ai le LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lens. Sa iloiloina ata i le ImageJ e faʻaaoga ai se pipeline na faʻamatalaina muamua ma le plugin ImageJ e fua ai le fusion ma le fission events, le averesi o le aofaʻi o mitochondrial structures, ma le averesi o le mitochondrial volume i le cell33. O loʻo maua MEL macros i luga o le GitHub (tagai i le Data Availability Statement).
Sa totoina sela SH-SY5Y i totonu o ipu e ono-pu i le mafiafia o le 0.3 × 106 sela/mL mo le 24 itula a'o le'i faia le togafitiga. Sa aveeseina le RNA e fa'aaoga ai le Quick-RNA™ Miniprep protocol (ZR R1055, Zymo Research) fa'atasi ai ma ni nai suiga laiti: fa'aopoopo le 300 μl o le RNA lysis buffer i pu ta'itasi a'o le'i aveeseina ma lyse fa'ata'ita'iga ta'itasi o se la'asaga mulimuli i le 30 μl o le DNase/RNase elution. -e leai se vai. Sa siakiina fa'ata'ita'iga uma mo le tele ma le lelei e fa'aaoga ai le NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Sa maua le aofa'i o porotini mai lysates o sela e fa'aaoga ai le 200 μl RIPA lysis buffer, ma sa fuaina le maualuga o le porotini e fa'aaoga ai le Bradford protein assay70.
Sa faia le fa'asologa o le cDNA e fa'aaoga ai le Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa fa'atasi ai ma ni nai suiga. Sa fa'aputuina le cDNA i ni tali e 20-μl e fa'aaoga ai le 0.7 i le 1 μg o le RNA atoa. Sa filifilia Primers mai pepa na lolomiina muamua 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Table S1) ma o probes na o fa'atasi ai sa mamanuina e fa'aaoga ai le meafaigaluega PrimerQuest mai le Integrated DNA Technologies. O genes uma e fiafia i ai sa fa'atulagaina i le nuclear B2M gene. O le fa'aalia o gene o STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ma le OPA1 sa fuaina e le RT-qPCR. O le fa'afefiloi autu e aofia ai le LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM primers agai i luma ma tua, cDNA, ma le vai PCR-grade e maua ai le voluma mulimuli e 10 μL mo tali ta'itasi. O le fa'aalia o genes o le vaevaega ma le fission (DRP1, MFN1/2) na fuaina e fa'aaoga ai le TaqMan multiplex assays. O le Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) na fa'aaoga e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa fa'atasi ai ma ni nai suiga laiti. O le fa'afefiloi autu multiplex RT-qPCR e aofia ai le 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM primers agai i luma ma tua, 10 μM probe, cDNA, ma le vai PCR-grade, ma i'u ai i le voluma mulimuli e 20 μL mo tali ta'itasi. Na faia le RT-qPCR e fa'aaoga ai le Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serial number: R0618110). O tulaga o le ta'amilosaga o lo'o fa'aalia i le Table S1. O faʻataʻitaʻiga uma o le cDNA sa faʻateleina i ni faʻatolu ma sa faia se piʻo masani e faʻaaoga ai se faasologa o faʻasuʻega e sefulu taimi. O mea e le o aofia i faʻataʻitaʻiga e tolu taimi ma le faʻasologa o le faʻasologa masani (Ct) >0.5 sa aveeseina mai le auʻiliʻiliga e faʻamautinoa ai le toe gaosia o faʻamaumauga30,72. O le faʻaalia o kenera faʻatatau sa fuafuaina e faʻaaoga ai le metotia 2-ΔΔCt79.
O fa'ata'ita'iga porotini (60 μg) na fa'afefiloi ma le Laemmli loading buffer i le fua fa'atatau 2:1 ma fa'agaoioia i luga o le 12% gel porotini e leai se lanu (Bio-Rad #1610184). Na fa'aliliuina porotini i totonu o le membrane PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) e fa'aaoga ai le Trans-Blot Turbo system (#170-4155, Bio-Rad). Na poloka le membrane ma fa'afefiloi ma antibodies autu talafeagai (OPA1, MFN1, MFN2, ma le DRP1) (fa'asusu 1:1000) mo le 48 itula, sosoo ai ma le fa'afefiloi ma antibodies lona lua (1:10,000) mo le 1 itula. Ona fa'ata'ita'iina lea o membranes e fa'aaoga ai le Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) ma fa'amaumauina e fa'aaoga ai le Bio-Rad ChemiDoc MP system. Na fa'aaoga le ImageLab version 6.1 mo le au'ili'iliga o le Western blot. O le gel ma le blot muamua o loʻo faʻaalia i le Ata S1. O faʻamatalaga o le antibody o loʻo tuʻuina atu i le Table S2.
O fa'amaumauga o lo'o tu'uina atu o le averesi ma le sese masani o le averesi (SEM) o le itiiti ifo ma le tolu fa'ata'ita'iga tuto'atasi. Sa fa'ata'ita'iina fa'amaumauga mo le tulaga masani e fa'aaoga ai le suega Shapiro-Wilks (se'i vagana ua fa'ailoa mai) a'o le'i fa'atatauina se tufatufaga Gaussian ma le tutusa o tulaga masani ma fa'aauau ai au'ili'iliga. I le fa'aopoopoga i le au'ili'iliga o le fa'amaumauga e fa'aaoga ai le Fisher's MEL LSD (p < 0.05), one-way ANOVA (togafitiga vs. averesi pulea), ma le Dunnett's multiple comparison test e iloa ai le taua (p < 0.05). O taua p taua o lo'o fa'aalia i le kalafi o le *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. O au'ili'iliga fa'amaumauga uma ma kalafi na fa'atinoina ma gaosia e fa'aaoga ai le GraphPad Prism 9.4.0.
O lo'o avanoa lautele i luga o le GitHub le Fiji/ImageJ macros mo le au'ili'iliga o ata TEM: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. O lo'o avanoa lautele fo'i le Mitochondrial Event Locator (MEL) macro i luga o le GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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