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O nanoparticles o le inisalini (NPs) e maualuga le utaina ua maua ai ni faʻaoga eseese i ituaiga eseese o tui. O lenei galuega e faʻamoemoe e iloilo le aʻafiaga o le faʻamagoina o le aisa ma le faʻamagoina o le faʻasusu i luga o le fausaga o nanoparticles chitosan ua utaina i le inisalini, faʻatasi ai ma le mannitol pe leai foi o se cryoprotectant. Na matou iloiloina foi le lelei o nei nanoparticles e ala i le toe faʻafefiloi. Aʻo leʻi faʻamagoina, o le tele o le vaega o le chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked nanoparticles na faʻaleleia i le 318 nm, o le PDI e 0.18, o le encapsulation efficiency e 99.4%, ma o le uta e 25.01%. Ina ua maeʻa ona toe faʻafouina, o nanoparticles uma, vagana ai na gaosia e ala i le faʻamagoina o le aisa e aunoa ma le faʻaaogaina o le mannitol, na tausia pea lo latou fausaga o le vaega lapotopoto. Pe a faʻatusatusa i nanoparticles o loʻo i ai le mannitol na faʻamagoina e ala i le faʻasusu, o nanoparticles faʻamagoina e aunoa ma le mannitol na faʻaalia ai foi le laʻititi o le averesi o le vaega (376 nm) ma le maualuga o le utaina. (25.02%) faatasi ai ma le fua faatatau tutusa o le encapsulation (98.7%) ma le PDI (0.20) e ala i metotia o le fa'amago po'o le fa'a'aisa. O nanoparticles fa'amago e ala i le fa'amagoina e aunoa ma le mannitol na mafua ai foi ona vave fa'asa'olotoina le inisalini ma le maualuga o le lelei o le fa'aaogaina o sela. O lenei galuega e fa'aalia ai e mafai e le fa'amagoina e ala i le fa'amagoina ona fa'amago nanoparticles o le inisalini e aunoa ma le mana'omia o cryoprotectants pe a fa'atusatusa i metotia masani o le fa'amagoina e aunoa ma le fa'a'aisa, ma fa'atupuina ai le tele o le gafatia e uta ai, mana'oga fa'aopoopo maualalo ma tau o galuega fa'atino e taua tele.
Talu mai lona mauaina i le 19221,2,3, o le inisalini ma ana sauniuniga fa'afoma'i ua fa'asaoina ai ola o tagata mama'i e maua i le ma'isuka ituaiga 1 (T1DM) ma le ma'isuka ituaiga 2 (T1DM). Peita'i, ona o ona uiga o se porotini mamafa molecular maualuga, e faigofie ona fa'aputuina le inisalini, fa'aleagaina e enzymes proteolytic, ma fa'aumatia e ala i le aafiaga muamua. O tagata e maua i le ma'isuka ituaiga 1 e mana'omia tui inisalini mo le olaga atoa. O le to'atele o tagata mama'i na muamua maua i le ma'isuka ituaiga 2 e mana'omia fo'i tui inisalini mo se taimi umi. O tui inisalini i aso ta'itasi o se puna tele o tiga ma le le to'a i aso ta'itasi mo nei tagata, fa'atasi ai ma a'afiaga leaga i le soifua maloloina o le mafaufau. O se taunuuga, o isi ituaiga o le tu'uina atu o le inisalini e mafua ai le le to'a, e pei o le tu'uina atu o le inisalini i le gutu, o lo'o su'esu'eina ma le loloto5 aua e iai le gafatia e toe fa'afo'isia ai le tulaga lelei o le olaga o le tusa ma le 5 piliona tagata e maua i le ma'isuka i le lalolagi atoa.
Ua maua e le tekinolosi nanoparticle se alualu i luma taua i taumafaiga e faʻaaogaina le insulin e tuiina4,6,7. O se tasi e faʻapipiʻi lelei ma puipuia le insulin mai le faʻaleagaina mo le tuʻuina atu faʻatatau i nofoaga faʻapitoa o le tino. Peitaʻi, o le faʻaaogaina o faʻatulagaga nanoparticle e iai ni faʻatapulaʻa, ona o mataupu tau le mautu o le faʻaputuina o vaega. Atonu e tupu nisi faʻaputuga i le taimi o le teuina, lea e faʻaitiitia ai le bioavailability o nanoparticles e tumu i le insulin8. E le gata i lea, e tatau foʻi ona mafaufau i le mautu faʻakemikolo o le polymer matrix o nanoparticles ma le insulin e faʻamautinoa ai le mautu o nanoparticles insulin (NPs). I le taimi nei, o le tekinolosi faʻamago-aisa o le tulaga auro mo le fatuina o NPs mautu aʻo puipuia ai suiga e le manaʻomia i le taimi o le teuina9.
Peita'i, o le fa'amagoina i le aisa e mana'omia ai le fa'aopoopoina o ni cryoprotectants e puipuia ai le fausaga lapotopoto o NPs mai le a'afia i le fa'alavelave fa'amekanika o tioata aisa. O lenei mea e fa'aitiitia ai le uta o nanoparticles o le insulin pe a uma le lyophilization, aua o le cryoprotectant e tele naua le fua fa'atatau o le mamafa. O le mea lea, o NPs o le insulin ua gaosia e masani ona iloa e le talafeagai mo le gaosia o fa'atulagaga pauta mago, e pei o papamaa tu'ugutu ma ata tu'ugutu, ona o le mana'omia o le tele o nanoparticles mago e ausia ai le fa'amalama fa'amalolo o le insulin.
O le fa'amagoina o le vai o se faiga lauiloa ma taugofie i le tele o pisinisi mo le gaosia o pauta mago mai vaega vai i le alamanuia o vaila'au10,11. O le puleaina o le faagasologa o le fausiaina o vaega e mafai ai ona fa'apipi'i lelei le tele o vaila'au fa'aolaola 12, 13. E le gata i lea, ua avea ma se metotia aoga mo le sauniaina o porotini fa'apipi'i mo le fa'aaogaina i le gutu. I le taimi o le fa'amagoina o le vai, e vave ona mago le vai, lea e fesoasoani e fa'aitiitia ai le vevela o le fatu o le vaega11,14, ma mafai ai ona fa'aogaina e fa'apipi'i ai vaega e ma'ale'ale i le vevela. A'o le'i fa'amagoina le vai, e tatau ona fa'afefiloi lelei le mea ufiufi ma le vaila'au o lo'o i ai mea fa'apipi'i11,14. E le pei o le fa'amagoina o le aisa, o le fa'afefiloi a'o le'i fa'apipi'iina i le fa'amagoina o le vai e fa'aleleia atili ai le lelei o le fa'apipi'iina i le taimi o le fa'amagoina o le vai. Talu ai ona e le mana'omia e le faagasologa o le fa'apipi'iina o le vai e le fa'apipi'iina o le vai e le fa'apipi'iina, e mafai ona fa'aaoga le fa'amagoina o le vai e gaosia ai NP mago ma le tele o mea e utaina.
O lenei suʻesuʻega o loʻo lipotia ai le gaosiga o NPs e tumu i le inisalini e ala i le faʻafesoʻotaʻiina o le chitosan ma le sodium tripolyphosphate e faʻaaoga ai le metotia o le ion gel. O le Ion gelation o se metotia sauniuni e mafai ai ona gaosia nanoparticles e ala i fegalegaleaiga eletise i le va o ni ituaiga ionic se lua pe sili atu i lalo o nisi tulaga. O metotia uma e lua o le faʻamago-aisa ma le faʻamago-faʻasusu na faʻaaogaina e faʻamago ai le chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked nanoparticles ua faʻaleleia atili. A maeʻa ona faʻamago, na suʻesuʻeina lo latou morphology e ala i le SEM. Na iloiloina lo latou gafatia toe faʻafouina e ala i le fuaina o lo latou tufatufaina atu o le tele, le mamafa o luga, PDI, le lelei o le encapsulation, ma le utaina o mea. O le lelei o nanoparticles ua faʻamaopoopoina na gaosia e auala eseese o le faʻamago na iloiloina foi e ala i le faʻatusatusaina o la latou puipuiga o le inisalini, amioga faʻasaʻoloto, ma le aoga o le faʻaaogaina o le sela.
O le pH o le vai fa'afefiloi ma le fua fa'atatau o le chitosan ma le insulin o ni mea taua se lua e a'afia ai le tele o le vaega ma le lelei o le encapsulation (EE) o NP mulimuli, aua e a'afia sa'o ai le fa'agasologa o le ionotropic gelation. O le pH o le vai fa'afefiloi na fa'aalia e matua feso'ota'i ma le tele o le vaega ma le lelei o le encapsulation (Ata 1a). E pei ona fa'aalia i le Ata 1a, a'o fa'ateleina le pH mai le 4.0 i le 6.0, na fa'aitiitia ai le averesi o le tele o le vaega (nm) ma fa'ateleina tele le EE, ae a'o fa'ateleina le pH i le 6.5, na amata ona fa'ateleina le averesi o le tele o le vaega ma tumau pea le EE e le'i suia. A'o fa'ateleina le fua fa'atatau o le chitosan i le insulin, e fa'ateleina fo'i le averesi o le tele o le vaega. E le gata i lea, e leai se suiga i le EE na matauina ina ua saunia nanoparticles i le fua fa'atatau o le chitosan/insulin e maualuga atu i le 2.5:1 (w/w) (Ata 1b). O le mea lea, o tulaga sili ona lelei o le sauniuniga i lenei su'esu'ega (pH 6.0, chitosan/insulin mass ratio o le 2.5:1) na fa'aaogaina e saunia nanoparticles ua tumu i le inisalini mo nisi suʻesuʻega. I lalo o lenei tulaga sauniuniga, o le averesi o le tele o le vaega o nanoparticles o le inisalini na faʻaleleia atili i le 318 nm (Ata 1c), o le PDI e 0.18, o le embedding efficiency e 99.4%, o le zeta potential e 9.8 mv, ma o le insulin loading e 25.01% (m/m). E faʻavae i luga o taunuuga o le transmission electron microscopy (TEM), o nanoparticles ua faʻaleleia atili sa toetoe lava a lapotopoto ma eseese ma e tutusa le tele (Ata 1d).
Fa'aleleia atili o le fa'asologa o nanoparticles o le insulin: (a) le a'afiaga o le pH i le averesi o le lautele ma le lelei o le encapsulation (EE) o nanoparticles o le insulin (saunia i le fua fa'atatau o le mamafa 5:1 o le chitosan ma le insulin); (b) chitosan ma le A'afiaga o le fua fa'atatau o le mamafa o le insulin i le averesi o le lautele ma le lelei o le encapsulation (EE) o NPs o le insulin (saunia i le pH 6); (c) tufatufaina o le tele o le vaega o nanoparticles o le insulin ua fa'aleleia atili; (d) TEM micrograph o NPs o le insulin ua fa'aleleia atili.
Ua lauiloa lelei o le chitosan o se polyelectrolyte vaivai ma le pKa o le 6.5. E molia lelei i totonu o ala oona ona o lona vaega autu o le amino e protonated e hydrogen ions15. O le mea lea, e masani ona faʻaaogaina o se avefeʻau e afifi ai macromolecules e molia leaga. I lenei suʻesuʻega, na faʻaaogaina ai le chitosan e afifi ai le insulin ma se isoelectric point o le 5.3. Talu ai ona faʻaaogaina le chitosan o se mea e ufiufi ai, faʻatasi ai ma le faʻateleina o lona vaega, o le mafiafia o le vaega pito i fafo o nanoparticles e faʻateleina ai, ma mafua ai ona tele le averesi o le tele o le vaega. E le gata i lea, o le maualuga o le chitosan e mafai ona afifi ai le tele o le insulin. I la matou tulaga, o le EE e sili ona maualuga pe a oʻo le fua faatatau o le chitosan ma le insulin i le 2.5:1, ma e leai se suiga taua i le EE pe a faʻaauau pea ona faʻateleina le fua faatatau.
E ese mai i le fua faatatau o le chitosan ma le insulin, sa i ai foi le sao taua o le pH i le sauniuniga o NPs. Na suʻesuʻeina e Gan et al. 17 le aafiaga o le pH i le tele o le vaega o nanoparticles chitosan. Na latou maua se faaitiitia faifai pea o le tele o le vaega seia oo i le pH i le 6.0, ma o se faateleina tele o le tele o le vaega na matauina i le pH > 6.0, lea e ogatasi ma a matou matauga. O lenei mea e mafua mai i le mea moni e faapea faatasi ai ma le faateleina o le pH, o le mole mole o le insulin e maua ai se totogi leaga i luga, o lea, e lagolagoina ai fegalegaleaiga eletise ma le chitosan/sodium tripolyphosphate (TPP) complex, ma iu ai i le laitiiti o le vaega ma le maualuga o le EE. Peitai, ina ua fetuunai le pH i le 6.5, o vaega amino i luga o le chitosan na aveesea le proton, ma iu ai i le gaugauina o le chitosan. O le mea lea, o le maualuga o le pH e mafua ai le itiiti ifo o le aafia o amino ions i le TPP ma le insulin, ma iu ai i le maualalo o le cross-linking, tele atu le averesi o le tele o le vaega ma le maualalo o le EE.
O le su'esu'eina o uiga fa'aletino o NPs ua fa'amago ma fa'asusu e mafai ona ta'ita'ia ai le filifilia o auala sili atu ona lelei mo le fa'amago ma le fausiaina o le pa'u. O le metotia e sili ona lelei e tatau ona maua ai le mautu o vaila'au, foliga tutusa o vaega, maualuga le uta o vaila'au ma le lelei o le solubility i le fofo muamua. I lenei su'esu'ega, ina ia fa'atusatusa lelei ai metotia e lua, o insulin NPs e iai pe leai foi le 1% mannitol na fa'aaogaina i le taimi o le fa'amago. O le Mannitol e fa'aaogaina o se mea e fa'aputu ai pe puipuia ai le malulu i le tele o fa'atulagaga o le pa'u mago mo le fa'amago ma le fa'amago. Mo nanoparticles insulin lyophilized e aunoa ma le mannitol, e pei ona fa'aalia i le Ata 2a, o se fausaga o le pa'u e tele naua le porous ma ni foliga tetele, e le tutusa ma le ma'a'a na matauina i lalo o le scanning electron microscopy (SEM). E na'o ni nai vaega eseese na iloa i le pa'u ina ua mae'a le fa'amago (Ata 2e). O nei taunu'uga na fa'aalia ai o le tele o NPs na pala i le taimi o le fa'amago e aunoa ma se puipuiga. Mo nanoparticles insulin ua fa'amago ma fa'asusu o lo'o iai le 1% mannitol, o nanoparticles spherical ma foliga lamolemole na matauina (Ata. 2b,d,f,h). O nanoparticles o le insulin na fa'amamago i le vai e aunoa ma le mannitol na tumau pea le lapotopoto ae na mimilo i luga (Ata 2c). O luga lapotopoto ma mimilo o lo'o talanoaina atili i le amioga fa'asa'oloto ma su'ega o le fa'aaogaina o sela i lalo. E fa'atatau i le foliga vaaia o NP na fa'amamago, o NP na fa'amamago i le vai e aunoa ma le mannitol ma NP na fa'a'aisa ma fa'amamago i le mannitol na maua ai ni pauta NP lelei (Ata 2f,g,h). O le tele o le lautele o le fogaeleele i le va o luga o le vaega, o le maualuga foi lea o le solubility ma o le mea lea e maualuga ai le fua fa'asa'oloto.
Fa'atulagaga o ituaiga eseese o inisalini NP ua mago: (a) Ata SEM o inisalini NP ua fa'amagoina e aunoa ma le mannitol; (b) Ata SEM o inisalini NP ua fa'amagoina ma le mannitol; (c) inisalini NP ua fa'asusuina e aunoa ma le mannitol Ata SEM o le ; (d) Ata SEM o inisalini NP ua fa'asusuina i le mannitol; (e) Ata o le pauta inisalini NP ua fa'amagoina e aunoa ma le mannitol; (f) Ata o inisalini NP ua fa'amagoina ma le mannitol; (g) Ata o le pauta inisalini NP ua fa'asusuina e aunoa ma le mannitol; (h) Ata o le pauta inisalini NP ua fa'asusuina ma le mannitol.
I le taimi o le fa'amagoina i le aisa, e galue le mannitol o se puipuiga mai le malulu (cryoprotectant), e taofia ai NPs i se foliga e leai se foliga ma puipuia ai le fa'aleagaina e tioata aisa19. I se fa'atusatusaga, e leai se la'asaga fa'amagoina i le taimi o le fa'amagoina i le vai. O le mea lea e le mana'omia ai le mannitol i lenei metotia. O le mea moni, o NPs fa'amagoina i le vai e aunoa ma le mannitol na maua ai ni NPs e sili atu ona lelei e pei ona fa'amatalaina muamua. Peita'i, e mafai lava e le mannitol ona galue o se mea e fa'atumu ai i le faiga o le fa'amagoina i le vai e tu'uina atu ai i NPs se fausaga e sili atu ona lapotopoto20 (Ata 2d), lea e fesoasoani e maua ai le amio tu'ufa'atasi o ia NPs ua afifiina. E le gata i lea, e manino lava o nisi o vaega tetele e mafai ona iloa i totonu o NPs insulin ua fa'amagoina i le aisa ma le fa'amagoina i le vai o lo'o i ai le mannitol (Ata 2b,d), lea atonu e mafua mai i le fa'aputuina o le mannitol i le fatu o le vaega fa'atasi ai ma le insulin ua afifiina. I le vaega o le Chitosan. E tāua le mātauina o lenei suʻesuʻega, ina ia mautinoa o loʻo tumau pea le fausaga lapotopoto pe a uma ona faʻamago, o le fua faatatau o le mannitol ma le chitosan e tausia i le 5:1, ina ia mafai ai e le tele o mea e faʻatumu ona faʻateleina ai le tele o le vaega o NP ua faʻamago.
O le Fourier transform infrared attenuated total reflection (FTIR-ATR) spectroscopy na faʻamatalaina ai le faʻafefiloi faaletino o le insulin saoloto, chitosan, chitosan, TPP ma le insulin. O NP uma ua mago na faʻamatalaina e ala i le faʻaaogaina o le FTIR-ATR spectroscopy. E taua tele, o le malosi o le fusi o le 1641, 1543 ma le 1412 cm-1 na matauina i totonu o NP ua afifiina ma faʻamago i le mannitol ma i totonu o NP ua faʻamago i le mannitol ma e aunoa ma le mannitol (Ata 3). E pei ona lipotia muamua, o nei faʻateleina o le malosi na fesoʻotaʻi ma le fesoʻotaʻiga i le va o le chitosan, TPP ma le insulin. O le suʻesuʻega o le fegalegaleaiga i le va o le chitosan ma le insulin na faʻaalia ai i totonu o le FTIR spectra o nanoparticles chitosan ua utaina i le insulin, o le fusi chitosan na ufiufi ma le insulin, ma faʻateleina ai le malosi o le carbonyl (1641 cm-1) ma le fusi amine (1543 cm-1). O vaega tripolyphosphate o le TPP e fesoʻotaʻi ma vaega ammonium i le chitosan, ma fausia ai se fusi. i le 1412 cm-1.
O le FTIR-ATR spectra o le insulin saoloto, chitosan, fa'afefiloi fa'aletino o le chitosan/TPP/insulin ma NPs ua fa'amago i auala eseese.
E le gata i lea, o nei taunuuga e ogatasi ma mea o loʻo faʻaalia i le SEM, lea na faʻaalia ai o NPs ua afifiina na tumau pea le lelei pe a faʻasusu ma faʻamago i le mannitol, ae i le leai o le mannitol, na o le faʻamago i le faʻasusu na maua ai ni vaega ua afifiina. I se faatusatusaga, o taunuuga o le FTIR-ATR spectral o NPs ua faʻamago i le faʻasusu e aunoa ma le mannitol e matua tutusa lava ma le paluga faaletino o le chitosan, TPP, ma le insulin. O lenei taunuuga e faʻaalia ai o fesoʻotaʻiga i le va o le chitosan, TPP ma le insulin ua le toe iai i NPs ua faʻamago i le faʻasusu e aunoa ma le mannitol. O le fausaga o le NPs na faʻaumatia i le taimi o le faʻamago i le faʻasusu e aunoa ma le cryoprotectant, lea e mafai ona vaʻaia i taunuuga o le SEM (Ata 2a). E faʻavae i luga o le morphology ma taunuuga o le FTIR o NPs insulin ua faʻamago, na o lyophilized, spray-dried, ma NPs e leai se mannitol na faʻaaogaina mo faʻataʻitaʻiga toe faʻaleleia ma NPs e leai se mannitol ona o le pala o NPs e leai se mannitol i le taimi o le faʻamago. talanoaina.
O le fa'amago vai e fa'aaogaina mo le teuina mo se taimi umi ma le toe fa'agasoloina i isi fa'atulagaga. O le gafatia o NP mago e toe fa'afouina pe a uma ona teuina e taua tele mo lo latou fa'aaogaina i fa'atulagaga eseese e pei o papa ma ata tifaga. Na matou matauina o le averesi o le tele o vaega o le insulin NPs ua fa'amamago i le leai o se mannitol na fa'ateleina teisi lava pe a uma ona toe fa'afouina. I le isi itu, o le tele o vaega o le insulin nanoparticles ua fa'amamago ma fa'a'aisa ma le mannitol na fa'ateleina tele (Laulau 1). O le PDI ma le EE e le'i suia tele (p > 0.05) pe a uma ona toe fa'afouina NPs uma i lenei su'esu'ega (Laulau 1). O lenei taunu'uga e fa'ailoa mai ai o le tele o vaega na tumau pea le lelei pe a uma ona toe fa'a'aisa. Peita'i, o le fa'aopoopoina o le mannitol na mafua ai ona matua fa'aitiitia le utaina o le insulin o le lyophilized ma le spray-dried mannitol nanoparticles (Laulau 1). I se fa'atusatusaga, o le aofa'i o le utaina o le insulin o NPs ua fa'amamago e aunoa ma le mannitol na tumau pea e pei ona muamua (Laulau 1).
Ua lauiloa lelei o le utaina o nanoparticles e taua tele pe a faʻaaogaina mo faʻamoemoega o le tuʻuina atu o vailaʻau. Mo NPs e maualalo le uta, e manaʻomia le tele o mea e oʻo atu ai i le tulaga faʻamalolo. Peitaʻi, o le maualuga o le viscosity o ia maualuga o le NP e oʻo atu ai i le faʻalavelave ma le faigata i le tuʻuina atu i le gutu ma faʻatulagaga tuiina, 22. E le gata i lea, e mafai foʻi ona faʻaaogaina NPs insulin e fai ai papa ma biofilms viscous23, 24, lea e manaʻomia ai le faʻaaogaina o le tele o NPs i tulaga maualalo o le uta, e mafua ai papa tetele ma biofilms mafiafia e le talafeagai mo faʻaoga i le gutu. O le mea lea, o NPs faʻamago ma le maualuga o le uta o le insulin e matua manaʻomia lava. O a matou taunuuga e faʻaalia ai o le maualuga o le uta o le insulin o NPs e leai se mannitol e mafai ona ofoina atu le tele o faʻamanuiaga manaia mo nei auala faʻatau atu.
O NP uma ua mago sa teuina i totonu o le pusaaisa mo le tolu masina. O taunuuga o le SEM na faaalia ai e leʻi suia tele le foliga o NP uma ua mago i le taimi o le teuina o le tolu masina (Ata 4). Ina ua maeʻa ona toe faʻafefiloi i le vai, o NP uma na faaalia ai se faaitiitia laitiiti i le EE ma faʻasaʻolotoina pe tusa ma le itiiti ifo (~5%) o le inisalini i le taimi o le teuina o le tolu masina (Laulau 2). Peitaʻi, o le averesi o le tele o le vaega o nanoparticles uma na faateleina. O le tele o le vaega o NP na faʻamamago e aunoa ma le mannitol na faateleina i le 525 nm, ae o NP na faʻamamago ma faʻaʻaisa ma le mannitol na faateleina i le 872 ma le 921 nm, i le faasologa (Laulau 2).
O le fausaga o ituaiga eseese o inisalini NP ua mago ma teuina mo le tolu masina: (a) Ata SEM o inisalini NP ua fa'amamago ma le mannitol; (b) Ata SEM o nanoparticles o inisalini ua fa'amamago e aunoa ma le mannitol; (c) e aunoa ma le mannitol Ata SEM o inisalini NP ua fa'amamago.
E le gata i lea, na vaaia ni mea na maua mai i totonu o nanoparticles o le insulin ua toe fa'afouina ma fa'amamago i le mannitol ma fa'amamago i le aisa (Ata S2). Atonu e mafua lenei mea ona o ni vaega tetele e le o tautau lelei i totonu o le vai. O taunuuga uma o lo'o i luga o lo'o fa'aalia ai e mafai e le metotia fa'amamago e mafai ona puipuia nanoparticles o le insulin mai le fa'amago ma e mafai ona maua ni uta maualuga o nanoparticles o le insulin e aunoa ma ni fa'atumu po'o ni cryoprotectants.
Sa tofotofoina le taofia o le inisalini i le pH = 2.5 medium faatasi ai ma le pepsin, trypsin, ma le α-chymotrypsin e faaalia ai le gafatia puipuia o NPs faasaga i le fa'agaseina o le enzymatic pe a uma ona mago. O le taofia o le inisalini o NPs mago na faatusatusa i le NPs fou saunia, ma le inisalini saoloto na faaaogaina o se pulea leaga. I lenei suesuega, o le inisalini saoloto na faaalia ai le vave aveeseina o le inisalini i totonu o le 4 itula i togafitiga uma e tolu o le enzymatic (Ata 5a–c). I se faatusatusaga, o le suega aveeseina o le inisalini o NPs na fa'amago-aisa i le mannitol ma NPs na fa'asusu-fa'amago ma le mannitol pe leai foi na faaalia ai le puipuiga maualuga tele o nei NPs faasaga i le fa'agaseina o le enzymatic, lea e tutusa ma le insulin NPs fou saunia (ata 1).5a-c). Faatasi ai ma le fesoasoani a nanoparticles i le pepsin, trypsin, ma le α-chymotrypsin, e silia ma le 50%, 60%, ma le 75% o le inisalini na mafai ona puipuia i totonu o le 4 itula, i le faasologa (Ata 5a–c). O lenei gafatia puipuia o le inisalini atonu fa'ateleina le avanoa e sili atu ai le mitiia o le inisalini i totonu o le toto25. O nei taunuuga e fa'ailoa mai ai o le fa'amagoina i le vai fa'atasi ai ma le mannitol pe leai fo'i ma le fa'amagoina i le mannitol e mafai ona fa'asaoina ai le malosi e puipuia ai le inisalini o NPs pe a uma ona fa'amago.
Puipuiga ma amioga fa'asa'oloto o NPs insulin mago: (a) puipuiga o le insulin i le vai pepsin; (b) puipuiga o le insulin i le vai trypsin; (c) puipuiga o le insulin e ala i le vai α-chymotrypsin; (d) Le amioga fa'asa'oloto o NPs mago i le vai pH = 2.5; (e) le amioga fa'asa'oloto o NPs mago i le vai pH = 6.6; (f) le amioga fa'asa'oloto o NPs mago i le vai pH = 7.0.
O insulin NPs mago ua faatoa saunia ma toe fa'afouina na fa'afuina i totonu o ni buffers eseese (pH = 2.5, 6.6, 7.0) i le 37 °C, e fa'ata'ita'i ai le siosiomaga o le pH o le manava, duodenum, ma le vaega pito i luga o le ga'au la'ititi, e su'esu'e ai le a'afiaga o le insulin i le tete'e atu i le insulin. Amioga fa'asa'oloto i siosiomaga eseese. Vaega o le ala o le gastrointestinal. I le pH = 2.5, o NPs ua fa'atumuina i le inisalini ma NPs o le inisalini mago ua toe fa'afo'isia na fa'aalia ai se fa'asa'oloto muamua i totonu o le itula muamua e tasi, sosoo ai ma se fa'asa'oloto lemu i le isi 5 itula (Ata 5d). O lenei fa'asa'oloto vave i le amataga e foliga mai o le taunuuga o le vave ona fa'aumatia o molela'au porotini e le'o atoatoa ona fa'agaoioia i totonu o le fausaga i totonu o le vaega. I le pH = 6.5, o NPs ua fa'atumuina i le inisalini ma NPs o le inisalini mago ua toe fa'afouina na fa'aalia ai se fa'asa'oloto lamolemole ma lemu i le silia ma le 6 itula, aua o le pH o le fofo fa'ata'ita'i e tutusa ma le fofo na saunia e le NPs (Ata 5e). I le pH = 7, o NPs e le mautu ma toetoe lava a pala atoa i totonu o le lua itula muamua (Ata 5f). O le mafua'aga lea ona o le deprotonation o le chitosan e tupu i le pH maualuga, lea e mafua ai se feso'ota'iga polymer e le o mafiafia ma le fa'asa'olotoina o le inisalini ua fa'atumuina.
E le gata i lea, o le inisalini NPs na fa'amamago e aunoa ma le mannitol na fa'aalia ai se fa'asologa vave o le fa'asa'olotoina nai lo isi NPs ua fa'amago (Ata 5d–f). E pei ona fa'amatalaina muamua, o le inisalini NPs ua toe fa'afouina ma fa'amago e aunoa ma le mannitol na fa'aalia ai le la'ititi o le vaega. O vaega laiti e maua ai se vaega tele, o lea o le tele o vaila'au talafeagai o le a i luga pe latalata i le fogāeleele o le vaega, ma i'u ai i le vave fa'asa'olotoina o vaila'au26.
Sa suʻesuʻeina le cytotoxicity o NPs e ala i le MTT assay. E pei ona faʻaalia i le Ata S4, o NP uma ua mago na maua e leai se aafiaga taua i le ola o sela i le maualuga o le 50–500 μg/ml, ma o loʻo faʻaalia ai o NP uma ua mago e mafai ona faʻaaogaina ma le saogalemu e oʻo atu ai i le taimi e faʻamalolo ai.
O le ate o le totoga autū lea e faʻatino ai e le inisalini ana galuega faʻaletino. O sela HepG2 o se laina o sela hepatoma o le tagata e masani ona faʻaaogaina o se faʻataʻitaʻiga o le faʻaaogaina o le hepatocyte in vitro. Iinei, na faʻaaogaina sela HepG2 e iloilo ai le faʻaaogaina o sela o NPs ua faʻamagoina e faʻaaoga ai metotia faʻamago-aisa ma faʻamago-faʻasusu. Faʻaaogaina o sela e ala i le confocal laser scanning e faʻaaoga ai le flow cytometry ma le vaʻai pe a maeʻa ni nai itula o le faʻasusuina ma le insulin FITC saoloto i le maualuga o le 25 μg/mL, NPs ua faʻatumuina i le inisalini FITC fou ma NPs ua faʻamagoina i le inisalini FITC i le tutusa o le maualuga o le inisalini. Na faia ni matauga quantitative microscopy (CLSM). NPs ua faʻamagoina e aunoa ma le mannitol na faʻaumatia i le taimi o le faʻamago ma e leʻi iloiloina i lenei suega. O le malosi o le fluorescence intracellular o NPs ua faʻatumuina i le inisalini fou, NPs ua faʻamagoina ma le mannitol, ma NPs ua faʻamago-faʻasusu ma e aunoa ma le mannitol (Ata 6a) e 4.3, 2.6, 2.4, ma le 4.1-fold maualuga atu nai lo o i latou e saoloto. Vaega FITC-insulin, i le faasologa lava (Ata 6b). O nei taunuuga e fautua mai ai o le inisalini ua afifiina e sili atu le malosi i le mitiia o sela nai lo le inisalini saoloto, ona o le laitiiti o le tele o nanoparticles ua utaina i le inisalini na gaosia i le suesuega.
Fa'aaogaina o le sela HepG2 pe a uma le 4 itula o le fa'asusuina i NP fou saunia ma NP ua mago: (a) Tu'ufa'atasiga o le fa'aaogaina o le FITC-insulin e sela HepG2.(b) Averesi fa'ata'atia o le malosi o le fluorescence na su'esu'eina e ala i le flow cytometry (n = 3), *P < 0.05 pe a fa'atusatusa i le insulin saoloto.
E fa'apena fo'i, o ata o le CLSM na fa'aalia ai o le malosi o le fluorescence FITC o NPs ua fa'ato'a saunia ma NPs ua fa'asusuina i le FITC (e aunoa ma le mannitol) sa sili atu le malolosi nai lo isi fa'ata'ita'iga (Ata 6a). E le gata i lea, fa'atasi ai ma le fa'aopoopoina o le mannitol, o le maualuga o le viscosity o le vaila'au na fa'ateleina ai le tete'e atu i le mitiia o sela, ma i'u ai ina fa'aitiitia le fa'ateleina o le insulin. O nei taunu'uga e fa'ailoa mai ai o NPs ua fa'asusuina i le mannitol e aunoa ma le fa'asusuina na fa'aalia ai le maualuga o le lelei o le mitiia o sela ona o lo latou lapo'a o le fasi vaega e la'ititi ifo nai lo NPs ua fa'amamago i le aisa pe a uma ona toe fa'ata'ape'apeina.
O le Chitosan (mamafa molecular averesi 100 KDa, 75–85% deacetylated) na faʻatau mai Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanata). O le Sodium tripolyphosphate (TPP) na faʻatau mai VWR (Radnor, Pennsylvania, ISA). O le insulin tagata recombinant na faʻaaogaina i lenei suʻesuʻega na mai Fisher Scientific (Waltham, MA, ISA). O le insulin tagata ua faʻailogaina i le Fluorescein isothiocyanate (FITC) ma le 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) na faʻatau mai Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanata). O le laina o le sela HepG2 na maua mai ATCC (Manassas, Virginia, ISA). O isi reagents uma na faʻavasegaina i le analytical poʻo le chromatographic.
Saunia se vaifofo CS e 1 mg/ml e ala i le fa'afefiloi i le vai fa'amamā fa'alua (vai DD) o lo'o i ai le 0.1% acetic acid. Saunia ni vaifofo 1 mg/ml o le TPP ma le insulin e ala i le fa'afefiloi i le vai DD ma le 0.1% acetic acid. O le pre-emulsion na saunia i se polytron PCU-2-110 high speed homogenizer (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ISA). O le faiga o le sauniuniga e fa'apea: muamua, e fa'aopoopo le 2ml o le vaifofo TPP i le 4ml o le vaifofo insulin, ma fa'agae'etia le paluga mo le 30 minute ma fa'afefiloi atoa. Ona fa'aopoopo lea o le vaifofo fefiloi i le vaifofo CS e ala i se syringe i lalo o le fa'agae'etia vave (10,000 rpm). O paluga na teuina i lalo o le fa'agae'etia vave (15,000 rpm) i totonu o se tapu aisa mo le 30 minute, ma na fetu'una'i i se pH patino e maua ai ni NP insulin feso'ota'i. Ina ia fa'afefiloi atili ma fa'aitiitia le tele o le vaega o NP insulin, sa fa'asusuina mo le isi 30 minute i totonu o se tapu aisa e fa'aaoga ai se sonicator ituaiga-probe (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Siamani).
Sa fa'ata'ita'iina le Insulin NPS mo le Z-average diameter, polydispersity index (PDI) ma le zeta potential e fa'aaoga ai fua fa'atatau o le dynamic light scattering (DLS) e fa'aaoga ai le Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) e ala i le fa'avaivaia i le vai DD i le 25°C. O le morphology ma le distribution size sa fa'ailoaina e le Hitachi H7600 transmission electron microscope (TEM) (Hitachi, Tokyo, Iapani), ma sa mulimuli ane su'esu'eina ata e fa'aaoga ai le Hitachi imaging software (Hitachi, Tokyo, Iapani). Ina ia iloilo le encapsulation efficiency (EE) ma le loading capacity (LC) o le insulin NPs, sa fa'apipi'iina NPs i totonu o ultrafiltration tubes ma le molecular weight cut-off o le 100 kDa ma centrifuged i le 500 xg mo le 30 minute. O le insulin e le'i fa'apipi'iina i totonu o le filtrate sa fuaina e fa'aaoga ai le Agilent 1100 Series HPLC system (Agilent, Santa Clara, Kalefonia, ISA) e aofia ai se quaternary pump, autosampler, column. le mea fa'avevela, ma le mea e iloa ai le DAD. Sa su'esu'eina le Inisalini e ala i se koluma C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, ISA) ma iloa i le 214 nm. O le vaega feavea'i o le acetonitrile ma le vai, o lo'o i ai le 0.1% TFA, fua fa'atatau o le gradient mai le 10/90 i le 100/0, ma fa'agaoioi mo le 10 minute. Sa pamuina le vaega feavea'i i le fua fa'atatau o le 1.0 ml/min. Sa setiina le vevela o le koluma i le 20 °C. Fa'atatau pasene o le EE ma le LC e fa'aaoga ai fua fa'atatau.(1) ma le Eq.(2).
Sa faia su'ega i fua fa'atatau eseese o le CS/insulin mai le 2.0 i le 4.0 ina ia fa'aleleia atili ai le insulin NP. Sa fa'aopoopoina ni aofa'iga eseese o le vaila'au CS i le taimi o le sauniuniga, a'o fa'atumauina pea le paluga o le insulin/TPP. Sa saunia NP o le Insulin i le pH e 4.0 i le 6.5 e ala i le fa'atonutonuina ma le fa'aeteete o le pH o le paluga ina ua uma ona fa'aopoopoina vaila'au uma (insulin, TPP ma le CS). Sa iloiloina le EE ma le tele o le vaega o nanoparticles o le insulin i tau eseese o le pH ma le fua fa'atatau o le mamafa o le CS/insulin ina ia fa'aleleia atili ai le fausiaina o NP o le insulin.
O insulin NPs ua fa'alelei atili sa tu'u i luga o le koneteina alumini ma ufiufi i se ie ua fa'amau fa'atasi ma se lipine. Mulimuli ane, o koneteina ua fa'amauina sa tu'u i totonu o se Labconco FreeZone freeze dryer (Labconco, Kansas City, MO, ISA) ua fa'apipi'iina i se tray dryer. O le vevela ma le mamafa o le vacuum sa setiina i le -10 °C, 0.350 Torr mo le 2 itula muamua, ma le 0 °C ma le 0.120 Torr mo le 22 itula o totoe o le 24 itula e maua ai ni insulin NPs mago.
Sa fa'aaogaina le Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Sueteselani) e gaosia ai le inisalini ua afifiina. O fa'ailoga na filifilia mo le fa'amagoina o le: vevela 100 °C, tafega o le fafaga 3 L/min, ma le tafega o le kesi 4 L/min.
O le Insulin NPs a'o le'i faia ma ina ua mae'a ona fa'amago sa fa'ailoaina e fa'aaoga ai le FTIR-ATR spectroscopy. O nanoparticles ua fa'amago fa'apea fo'i ma le insulin saoloto ma le chitosan sa su'esu'eina e fa'aaoga ai le Spectrum 100 FTIR spectrophotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ISA) ua fa'apipi'iina i se mea fa'aopoopo fa'ata'ita'i ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ISA). O averesi o fa'ailoga na maua mai le 16 scans i le iugafono o le 4 cm2 i le vaega o le 4000-600 cm2.
Sa iloiloina le fausaga o le insulin NPs mago e ala i ata SEM o le insulin NPs ua fa'amago-aisa ma le insulin NPs ua fa'asusu-fa'amago na pu'eina e le Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, ISA). O le parakalafa autū na fa'aaogaina o le voltage 5 keV ma le current 30 mA.
O NP uma o le inisalini ua fa'amago sa toe fa'afefiloi i le vai dd. O le tele o le vaega, PDI, EE ma le LC sa toe faia su'ega e fa'aaoga ai le metotia lava e tasi na ta'ua muamua e iloilo ai lo latou lelei pe a uma ona fa'amago. O le mautu o NP anhydroinsulin sa fuaina fo'i e ala i le su'eina o meatotino o NP pe a uma ona teuina mo se taimi umi. I lenei su'esu'ega, o NP uma pe a uma ona fa'amago sa teuina i totonu o le pusaaisa mo le tolu masina. A mae'a masina e tolu o le teuina, sa faia su'ega o NP mo le tele o le morphological o le vaega, PDI, EE ma le LC.
Fa'afefiloi le 5 mL o NP ua toe fa'afouina i totonu o le 45 mL o lo'o i ai le sua o le manava fa'ata'ita'i (pH 1.2, o lo'o i ai le 1% pepsin), sua o le manava (pH 6.8, o lo'o i ai le 1% trypsin) po'o le vaila'au chymotrypsin (100 g/mL, i le phosphate buffer, pH 7.8) e iloilo ai le aoga o le insulin i le puipuia o NP pe a uma ona fa'amago. Na fa'asusu i latou i le 37°C i le saoasaoa o le fa'agae'etia o le 100 rpm. 500 μL o le vaila'au na aoina i taimi eseese ma na fuafuaina le maualuga o le insulin e ala i le HPLC.
O le amioga fa'asa'oloto in vitro o NPs insulin fou saunia ma fa'amago na fa'ata'ita'iina e ala i le metotia o le taga dialysis (molecular weight cut-off 100 kDa, Spectra Por Inc.). O NPs mago fou saunia ma toe fa'afouina na fa'amago i vai i le pH 2.5, pH 6.6, ma le pH 7.0 (0.1 M phosphate-buffered saline, PBS) e fa'ata'ita'i ai le siosiomaga pH o le manava, duodenum, ma le pito i luga o le manava la'ititi. O fa'ata'ita'iga uma na fa'asusu i le 37 °C ma le lūlūina pea i le 200 rpm. Fa'asusu le vai i fafo atu o le taga dialysis 5 mL i taimi nei: 0.5, 1, 2, 3, 4, ma le 6 itula, ma toe fa'atumu loa le voluma i le dialysate fou. O le fa'aleagaina o le insulin i le vai na su'esu'eina e le HPLC, ma o le fua faatatau o le fa'asa'olotoina o le insulin mai nanoparticles na fuafuaina mai le fua faatatau o le insulin saoloto na fa'asa'olotoina i le insulin atoa o lo'o i totonu o nanoparticles (Equation 3).
O sela HepG2 o le kanesa o le ate o le tagata na totoina i totonu o ipu e 60 mm le lautele e faʻaaoga ai le Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) o loʻo i ai le 10% o le serum o le povi fetal, 100 IU/mL penicillin, ma le 100 μg/mL streptomycin29. Na tausia faʻatoʻaga i le 37°C, 95% le susu faʻatatau, ma le 5% CO2. Mo suʻega faʻaaogā, na totoina sela HepG2 i le 1 × 105 sela/ml i luga o le 8-well Nunc Lab-Tek chamber slide system (Thermo Fisher, NY, ISA). Mo suʻega cytotoxicity, na totoina i totonu o ipu e 96-well (Corning, NY, ISA) i le mafiafia o le 5 × 104 sela/ml.
Sa fa'aaogaina le su'ega MTT e iloilo ai le cytotoxicity o le insulin NPs30 ua saunia fou ma ua fa'amago. O sela HepG2 sa totoina i totonu o ipu e 96-well i le mafiafia o le 5 × 104 sela/mL ma fa'ato'aga mo le 7 aso a'o le'i faia le su'ega. O NPs Insulin sa fa'afefiloi i ni tulaga eseese (50 i le 500 μg/mL) i totonu o le vaila'au fa'ato'aga ona tu'uina atu lea i sela. A mae'a le 24 itula o le fa'ato'aga, sa fufuluina sela fa'atolu i le PBS ma fa'ato'aga i le vaila'au o lo'o i ai le 0.5 mg/ml MTT mo le isi 4 itula. Sa iloiloina le cytotoxicity e ala i le fuaina o le fa'aitiitia o le enzymatic o le tetrazolium MTT samasama i le formazan violē i le 570 nm e fa'aaoga ai le Tecan infinite M200 pro spectrophotometer plate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland).
O le lelei o le fa'aaogāina o sela o NPs na fa'ata'ita'iina e ala i le confocal laser scanning microscopy ma le flow cytometry analysis. O pu ta'itasi o le Nunc Lab-Tek chamber slide system na togafitia i le free FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NPs, ma toe fa'afouina le 25 μg/mL o le dehydrated FITC-insulin NPs i le tutusa o le malosi ma fa'asusu mo le 4 itula. Na fufuluina sela i le 3 taimi i le PBS ma fa'amautu i le 4% paraformaldehyde. Na valiina nuclei i le 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Na matauina le fa'aogaina o le insulin e fa'aaoga ai le Olympus FV1000 laser scanning/two-photon confocal microscope (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Iapani). Mo le flow cytometry analysis, o le tutusa o le malosi o le 10 μg/mL free FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NPs, ma resolubilized dehydrated FITC-insulin NPs na fa'aopoopoina i le 96-well plates na totoina i sela HepG2 ma fa'asusu mo le 4 itula. A maeʻa le 4 itula o le faʻasusuina, ona aveese lea o sela ma fufuluina faʻatolu i le FBS. 5 × 104 sela i le faʻataʻitaʻiga na suʻesuʻeina e le BD LSR II flow cytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Iunaite Setete).
O tau uma o loʻo faʻaalia o le averesi ± le faʻasologa masani. O faʻatusatusaga i le va o vaega uma na iloiloina e faʻaaoga ai le ANOVA e tasi le itu poʻo le t-test e le IBM SPSS Statistics 26 mo Mac (IBM, Endicott, Niu Ioka, ISA) ma o le p < 0.05 na manatu o se taua faʻamaumauga.
O lenei suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai le fetuutuunaʻi ma le gafatia o le faʻamagoina o le suāvai e faʻamago ai nanoparticles o le chitosan/TPP/insulin ua fesoʻotaʻi faʻatasi ma le toe faʻaleleia atili pe a faʻatusatusa i metotia masani o le faʻamagoina o le aisa e faʻaaogaina ai mea faʻapipiʻi poʻo le gafatia o le cryoprotectants ma le gafatia maualuga o le uta. O nanoparticles o le insulin ua faʻaleleia atili na maua ai le tele o le vaega e 318 nm ma le lelei o le encapsulation e 99.4%. O taunuʻuga o le SEM ma le FTIR ina ua maeʻa le faʻamagoina na faʻaalia ai o le fausaga spherical na tausia naʻo NPs ua faʻamagoina ma le leai o le mannitol ma faʻamagoina i le mannitol, ae o NPs ua faʻamagoina e aunoa ma le mannitol na pala i le taimi o le faʻamagoina. I le suʻega gafatia o le toe faʻaleleia, o nanoparticles o le insulin ua faʻamagoina e aunoa ma le mannitol na faʻaalia ai le laʻititi o le tele o le vaega ma le maualuga o le uta i le taimi o le toe faʻaleleia. O amioga faʻasaʻoloto o nei NPs uma ua faʻamagoina na faʻaalia ai na vave ona faʻasaʻolotoina i fofo o le pH = 2.5 ma le pH = 7, ma e matua mautu lava i fofo o le pH = 6.5. Pe a faʻatusatusa i isi NPs ua toe faʻamagoina, o NPs O le fa'amamago fa'asusu e aunoa ma le mannitol na fa'aalia ai le vave tele o le fa'asa'olotoina. O lenei taunu'uga e ogatasi ma le mea na matauina i le su'ega o le fa'aaogaina o le sela, aua o NP fa'amamago fa'asusu i le leai o se mannitol e toetoe lava a fa'atumauina atoatoa le lelei o le fa'aaogaina o le sela o NP fou saunia. O nei taunu'uga e fa'ailoa mai ai o nanoparticles o le insulin mago na saunia e le fa'amamago fa'asusu e aunoa ma le mannitol e sili ona talafeagai mo le fa'agasolo atili i isi ituaiga vaila'au e leai se vai, e pei o papamaa tu'ugutu po'o ata tifaga bioadhesive.
Ona o mataupu tau meatotino tau le atamai, o faʻamaumauga na gaosia ma/pe iloiloina i le taimi o le suʻesuʻega o loʻo faia nei e le o avanoa mo tagata lautele, ae o loʻo avanoa mai tusitala taʻitasi pe a talosagaina talafeagai.
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