O le tusiga o se vaega o le autu o suʻesuʻega "Faʻaleleia atili o le teteʻe o lemu i siama ma manu faalafua", silasila i tusiga uma e 5
O le mafuaʻaga o le faʻamaʻi fungal o laʻau o le Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary e faʻaaogaina se fuafuaga e tele-vaega e aʻafia ai laʻau eseese. O lenei suʻesuʻega ua fautuaina ai le faʻaaogaina o le diamine L-ornithine, o se amino acid e le o se porotini e faʻaosofia ai le faia o isi amino acids taua, o se isi fuafuaga e pulea ai e faʻaleleia atili ai tali faʻale-molecular, physiological ma biochemical o le Phaseolus vulgaris L. i le ele paʻepaʻe e mafua mai i le Pseudomonas sclerotiorum. O suʻesuʻega in vitro na faʻaalia ai o le L-ornithine na matua taofia ai le tuputupu aʻe o le mycelial o le S. pyrenoidosa i se auala e faʻalagolago i le fua. E le gata i lea, e mafai ona faʻaitiitia tele ai le ogaoga o le ele paʻepaʻe i lalo o tulaga o le fale lauʻeleʻele. E le gata i lea, na faʻaosofia e le L-ornithine le tuputupu aʻe o laʻau na togafitia, ma faʻaalia ai o le tele o le L-ornithine na tofotofoina e le oona i laʻau na togafitia. E le gata i lea, na faʻaleleia atili e le L-ornithine le faʻaalia o antioxidants e le o ni enzymatic (total soluble phenolics ma flavonoids) ma antioxidants enzymatic (catalase (CAT), peroxidase (POX), ma le polyphenol oxidase (PPO)), ma faʻateleina ai le faʻaalia o genes e tolu e fesoʻotaʻi ma antioxidants (PvCAT1, PvSOD, ma PvGR). E le gata i lea, o le suʻesuʻega i le silico na faʻaalia ai le i ai o se porotini oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) i le genome o le S. sclerotiorum, lea e matua tutusa lava ma porotini oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) o le Aspergillus fijiensis (AfOAH) ma le Penicillium sp. (PlOAH) i tulaga o le suʻesuʻega faʻatino, vaega faʻasao, ma le topology. O le mea e malie ai, o le faʻaopoopoina o le L-ornithine i le pateta dextrose broth (PDB) medium na faʻaitiitia ai le faʻaalia o le gene SsOAH i le S. sclerotiorum mycelia. I se tulaga tutusa, o le faʻaaogaina i fafo o le L-ornithine na matua faʻaitiitia ai le faʻaalia o le SsOAH gene i totonu o fungal mycelia na aoina mai laʻau na togafitia. Ma le mea mulimuli, o le faʻaaogaina o le L-ornithine na matua faʻaitiitia ai le faʻasaʻolotoina o le oxalic acid i totonu o le PDB medium ma laulaau ua aʻafia. I le faʻaiʻuga, o le L-ornithine e taua tele i le faʻatumauina o le tulaga redox faʻapea foʻi ma le faʻaleleia atili o le tali atu i le puipuiga o laʻau ua aʻafia. O taunuʻuga o lenei suʻesuʻega e mafai ona fesoasoani i le atinaʻeina o ni metotia fou ma lelei mo le siosiomaga e pulea ai le white ell ma faʻaitiitia ai lona aʻafiaga i le gaosiga o pi ma isi faʻatoʻaga.
O le popole paʻepaʻe, e mafua mai i le siama necrotrophic Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, o se faʻamaʻi mataʻutia ma faʻaitiitia ai le fua e mafua ai se lamatiaga tele i le gaosiga o pi i le lalolagi atoa (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). O le Sclerotinia sclerotiorum o se tasi o siama sili ona faigata ona pulea e ala i le eleele, faatasi ai ma se vaega lautele o laau e silia ma le 600 ituaiga ma le mafai ona vave faʻaleagaina aano o le laau i se auala e le o patino (Liang ma Rollins, 2018). I lalo o tulaga le lelei, e oo atu i se vaega taua o lona olaga, e tumau ai i le moe mo se taimi umi e pei o ni fausaga uliuli, malo, e pei o fatu e taʻua o le 'sclerotia' i le eleele poʻo ni tuputupu aʻe paʻepaʻe ma fulufulua i le mycelium poʻo le pith o le ogalaau o laau ua aʻafia (Schwartz et al., 2005). E mafai e le S. sclerotiorum ona fausia le sclerotia, lea e mafai ai ona ola i fanua ua a'afia mo se taimi umi ma tumau ai i taimi o fa'ama'i (Schwartz et al., 2005). E tele mea'ai a le Sclerotia, e mafai ona tumau i le eleele mo se taimi umi, ma avea o se tui autu mo fa'ama'i pipisi (Schwartz et al., 2005). I lalo o tulaga lelei, e ola le sclerotia ma gaosia ai ni spores e felelei i le ea e mafai ona a'afia ai vaega uma o le la'au i luga a'e o le eleele, e aofia ai ae le gata i fugāla'au, 'au, po'o fatu (Schwartz et al., 2005).
E fa'aaogā e le Sclerotinia sclerotiorum se fuafuaga e tele ona vaega e a'afia ai la'au e talimalo ai, e aofia ai se faasologa o mea tutupu fa'atasi mai le tuputupu a'e o le sclerotial i le atina'eina o fa'ailoga. I le amataga, e gaosia e le S. sclerotiorum ni spores tautau (e ta'ua o ascospores) mai fausaga e pei o pulouaitu e ta'ua o le apothecia, lea e felelei i le ea ma atiina ae i ni sclerotia e le gaoioi i luga o otaota o la'au ua a'afia (Bolton et al., 2006). Ona fa'asa'oloto lea e le fungus le oxalic acid, o se mea e mafua ai le malosi, e pulea ai le pH o le puipui o le sela o le la'au, fa'alauiloa ai le fa'aleagaina o le enzymatic ma le osofa'iga o a'ano (Hegedus ma Rimmer, 2005), ma taofia ai le pa o le oxidative burst o le la'au talimalo. O lenei faiga o le acidification e fa'avaivaia ai le puipui o le sela o le la'au, ma maua ai se siosiomaga lelei mo le fa'agaioiga masani ma lelei o enzymes e fa'aleagaina ai le puipui o le sela o le fungal (CWDEs), ma fa'atagaina ai le pathogen e faato'ilalo le pa puipui fa'aletino ma ulufale atu i a'ano talimalo (Marciano et al., 1983). O le taimi lava e ulu atu ai i totonu, e fa'asa'olotoina e le S. sclerotiorum le tele o CWDEs, e pei o le polygalacturonase ma le cellulase, lea e fa'afaigofieina ai lona salalau atu i totonu o a'ano ua a'afia ma mafua ai le necrosis o a'ano. O le alualu i luma o manu'a ma hyphal mats e o'o atu ai i fa'ailoga iloga o le white empty (Hegedus ma Rimmer, 2005). I le taimi nei, e iloa e la'au talimalo ia mamanu molecular e feso'ota'i ma pathogen (PAMPs) e ala i le pattern recognition receptors (PRRs), ma fa'aosofia ai se fa'asologa o mea fa'ailoilo e iu ai ina fa'agaoioia tali puipuiga.
E ui i le tele o tausaga o taumafaiga e pulea ai faʻamaʻi, ae o loʻo tumau pea le le lava o le germplasm teteʻe i pi, e pei o isi faʻatoʻaga faapisinisi, ona o le teteʻe, ola, ma le fetuutuunaʻi o le pathogen. O le mea lea, o le puleaina o faʻamaʻi e matua faigata lava ma e manaʻomia ai se fuafuaga tuʻufaʻatasia ma le tele o itu e aofia ai le tuʻufaʻatasia o faiga faʻaleaganuʻu, puleaina o meaola faʻapitoa, ma vailaʻau faʻamaʻi (O'Sullivan et al., 2021). O le puleaina o vailaʻau faʻakemikolo o le limu paʻepaʻe e sili ona aoga aua o vailaʻau faʻamaʻi, pe a faʻaaogaina saʻo ma i le taimi saʻo, e mafai ona pulea lelei le salalau o le faʻamaʻi, faʻaitiitia le ogaoga o faʻamaʻi, ma faʻaitiitia ai le leiloa o fua. Peitaʻi, o le soʻona faʻaaogaina ma le faʻalagolago tele i vailaʻau faʻamaʻi e mafai ona oʻo atu ai i le tulaʻi mai o ituaiga teteʻe o le S. sclerotiorum ma aʻafia ai meaola e le o faʻatatau i ai, soifua maloloina o le eleele, ma le lelei o le vai (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). O le mea lea, o le sailia o isi auala e le afaina ai le siosiomaga ua avea ma mea e sili ona taua.
O Polyamines (PAs), e pei o le putrescine, spermidine, spermine, ma le cadaverine, e mafai ona avea o ni isi auala lelei e tetee atu ai i siama o la'au e feavea'i i le eleele, ma fa'aitiitia atoa ai pe fa'aitiitia ai fo'i le fa'aaogaina o vaila'au fa'ama'i pipisi matautia (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). I la'au maualuluga, e a'afia PAs i le tele o faiga fa'aletino e aofia ai, ae le fa'atapula'aina i, vaevaega o sela, fa'avasegaina, ma le tali atu i fa'alavelave fa'aletino ma fa'aletino (Killiny ma Nehela, 2020). E mafai ona latou galulue o ni antioxidants, fesoasoani e fa'amamā le reactive oxygen species (ROS), fa'atumauina le redox homeostasis (Nehela ma Killiny, 2023), fa'aosofia ni genes e feso'ota'i ma le puipuiga (Romero et al., 2018), fa'atonutonu auala eseese o le metabolism (Nehela ma Killiny, 2023), fa'atonutonu phytohormones endogenous (Nehela ma Killiny, 2019), fa'atuina le systemic acquired resistance (SAR), ma fa'atonutonu fegalegaleaiga a la'au ma pathogens (Nehela ma Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). E taua le maitauina o faiga fa'apitoa ma matafaioi a PAs i le puipuiga o la'au e eseese e fa'atatau i ituaiga o la'au, pathogens, ma tulaga o le siosiomaga. O le PA e sili ona tele i la'au e biosynthesized mai le polyamine taua L-ornithine (Killiny ma Nehela, 2020).
E tele matafaioi a le L-ornithine i le tuputupu aʻe ma le atinaʻeina o laʻau. Mo se faʻataʻitaʻiga, o suʻesuʻega ua mavae ua faʻaalia ai i le araisa (Oryza sativa), e ono fesoʻotaʻi le ornithine ma le toe faʻaaogaina o le nitrogen (Liu et al., 2018), le fua o le araisa, le lelei ma le manogi (Lu et al., 2020), ma le tali atu i faigata o le vai (Yang et al., 2000). E le gata i lea, o le faʻaaogaina o le L-ornithine i fafo na faʻaleleia atili ai le onosaʻi i le lāmala i le sugar beet (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) ma faʻaitiitia ai le atuatuvale o le masima i le aniani (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ma Çavuşoǧlu, 2021) ma laʻau cashew (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). O le matafaioi ono mafai o le L-ornithine i le puipuiga o faigata abiotic atonu e mafua mai i lona aʻafia i le faʻaputuina o proline i laʻau ua togafitia. Mo se faʻataʻitaʻiga, o kene e fesoʻotaʻi ma le metabolism o le proline, e pei o le ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) ma le proline dehydrogenase (ProDH1 ma le ProDH2) genes, ua lipotia muamua o loʻo aʻafia i le puipuiga o Nicotiana benthamiana ma Arabidopsis thaliana mai ituaiga Pseudomonas syringae e le o ni talimalo (Senthil-Kumar ma Mysore, 2012). I le isi itu, o le fungal ornithine decarboxylase (ODC) e manaʻomia mo le tuputupu aʻe o pathogen (Singh et al., 2020). O le faʻatatauina o le ODC o le Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici e ala i le host-induced gene silencing (HIGS) na faʻaleleia atili ai le teteʻe atu o laʻau tamato i le Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Peitaʻi, o le matafaioi e ono mafai ona faia e le faʻaaogaina o le exogenous ornithine e faʻasaga i faʻalavelave faʻalenatura e pei o phytopathogens e leʻi suʻesuʻeina lelei. O le mea e sili ona tāua, o aʻafiaga o le ornithine i le teteʻe atu i faʻamaʻi ma mea faʻapitoa faʻakemikolo ma faʻaletino e fesoʻotaʻi i ai e leʻi suʻesuʻeina lava.
O le malamalama i le faigata o le aʻafia o le S. sclerotiorum i pi e taua tele mo le atinaʻeina o ni fuafuaga lelei e pulea ai. I lenei suʻesuʻega, na matou faʻamoemoe e faʻailoa le matafaioi autu o le diamine L-ornithine o se mea taua i le faʻaleleia atili o auala e puipuia ai ma le teteʻe atu o laʻau pi i le aʻafia o le Sclerotinia sclerotiorum. Matou te manatu, e le gata i le faʻaleleia atili o tali puipuia o laʻau ua aʻafia, ae o le L-ornithine foʻi e iai sona sao taua i le tausia o le tulaga redox. Matou te fautuaina o aafiaga autu o le L-ornithine e fesoʻotaʻi ma le faʻatonutonuina o auala e puipuia ai le antioxidant e le o ni enzymes ma e le o ni enzymes ma le faʻalavelaveina o mea e mafua ai le pathogenicity/virulence fungal ma porotini e fesoʻotaʻi i ai. O lenei galuega faʻalua o le L-ornithine ua avea ai ma sui tauva folafolaina mo se fuafuaga gafataulimaina e faʻaitiitia ai le aʻafiaga o le ele paʻepaʻe ma faʻaleleia atili ai le teteʻe atu o laʻau pi masani i lenei siama fungal malosi. O taunuʻuga o le suʻesuʻega o loʻo iai nei e mafai ona fesoasoani i le atinaʻeina o ni metotia fou ma lelei mo le siosiomaga e pulea ai le ele paʻepaʻe ma faʻaitiitia ai lona aʻafiaga i le gaosiga o pi.
I lenei suʻesuʻega, o se ituaiga pi masani e faigofie ona aʻafia, o le Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), na faʻaaogaina e fai ma mea faʻataʻitaʻi. O fatu maloloina na saunia ma le agalelei e le Matagaluega o Suʻesuʻega Legume, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Aikupito. E lima fatu na lūlūina i totonu o ulo palasitika (lapopoʻa i totonu 35 cm, loloto 50 cm) na faʻatumuina i le eleele ua aʻafia i le S. sclerotiorum i lalo o tulaga fale lauʻeleʻele (25 ± 2 °C, susū o le ea 75 ± 1%, 8 itula malamalama/16 itula pogisa). I le 7–10 aso talu ona lūlūina (DPS), na faʻamamago ai laʻau ina ia naʻo ni laʻau se lua e tutusa le tuputupu aʻe ma ni lau e tolu ua matua faʻalauteleina i totonu o ulo taʻitasi. O laʻau uma i totonu o ulo na faʻasūsūina i vaiaso taʻitasi ma faʻapalaina i masina taʻitasi i le fua faʻatatau fautuaina mo le ituaiga na tuʻuina atu.
Mo le saunia o le 500 mg/L o le L-ornithinediamine (e taʻua foʻi o le (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Siamani), na faʻafefiloi muamua le 50 mg i le 100 mL o le vai mama. Ona faʻafefiloi lea o le vai faʻaputu ma faʻaaoga i faʻataʻitaʻiga mulimuli ane. I se faapuupuuga, e ono faasologa o le L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, ma le 125 mg/L) na faia suʻega i totonu o le vitro. E le gata i lea, na faʻaaogaina le vai mama e fai ma faʻataʻitaʻiga lelei (Mock) ma le fungicide faʻapisinisi "Rizolex-T" 50% pauta susu (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Aikupito) na faʻaaogaina o se faʻataʻitaʻiga lelei. Sa faia su'ega i totonu o le vitro le vaila'au fa'asaina fa'apisinisi "Rizolex-T" i le tele e lima (2, 4, 6, 8 ma le 10 mg/L).
O faʻataʻitaʻiga o au o pi ma fualaʻau e masani ona faʻaalia ai faʻailoga masani o le popole paʻepaʻe (fua faatatau o le pipisi: 10–30%) na aoina mai faʻatoʻaga faapisinisi. E ui o le tele o laʻau ua aʻafia na faʻailoaina e ala i ituaiga/ituaiga (ituaiga faapisinisi e faigofie ona aʻafia Giza 3), o isi, aemaise lava i latou na maua mai maketi i le lotoifale, e le o iloa ituaiga. O mea ua aʻafia na aoina na muamua faʻamamāina le luga i le 0.5% sodium hypochlorite solution mo le 3 minute, ona fufulu lea i ni nai taimi i le vai mama ma solo mago i le pepa faamama mama e aveese ai le tele o le vai. Ona tipiina lea o totoga ua aʻafia i ni fasi vaega laiti mai le ogatotonu o le tino (i le va o aʻano maloloina ma aʻano ua aʻafia), totoina i luga o le pateta dextrose agar (PDA) ma faʻasusu i le 25 ± 2 °C ma se 12 itula malamalama/12 itula pogisa mo le 5 aso e faʻaosofia ai le fausiaina o sclerotia. O le metotia o le mycelial tip na faʻaaogaina foi e faʻamamā ai siama fungal mai faʻatoʻaga fefiloi pe ua pisia. O siama fungal ua faʻamamāina na muamua faʻailoaina e faʻavae i luga o ona uiga faʻaleaganuu ona faʻamaonia lea o le S. sclerotiorum e faʻavae i luga o foliga faʻamikroskopi. I le iuga, o pi uma ua fa'amamāina sa fa'ata'ita'iina mo le fa'ama'i i le ituaiga pi masani o le Giza 3 e a'afia ai ina ia fetaui ma tulaga fa'atonuina a Koch.
E le gata i lea, o le S. sclerotiorum isolate sili ona fa'alavelave (isolate #3) na toe fa'amaonia e fa'avae i luga o le internal transcribed spacer (ITS) sequencing e pei ona fa'amatalaina e White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. I se aotelega, o isolates na totoina i le potato dextrose broth (PDB) ma fa'asusu i le 25 ± 2 °C mo le 5–7 aso. Ona aoina lea o le fungal mycelium, fa'amama i le cheesecloth, fufulu fa'alua i le vai mama, ma fa'amago i le pepa fa'amama mama. Na vavae'eseina le genomic DNA e fa'aaoga ai le Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Ona fa'ateleina lea o le vaega o le ITS rDNA e fa'aaoga ai le paga fa'apitoa o le primer ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; tele fa'amoemoeina: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). O oloa PCR ua fa'amamāina na tu'uina atu mo le fa'asologa (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). O fa'asologa o le ITS rDNA na fa'asologaina i itu e lua e fa'aaoga ai le metotia o le fa'asologa o le Sanger. Ona fa'atusatusa lea o fa'asologa o fesili na tu'ufa'atasia ma fa'amatalaga lata mai i le GenBank ma le National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) e fa'aaoga ai le polokalama BLASTn. Na fa'atusatusa le fa'asologa o fesili ma isi ituaiga/isolates e 20 o le S. sclerotiorum na maua mai fa'amatalaga lata mai i le NCBI GenBank (Supplementary Table S1) e fa'aaoga ai le ClustalW i le Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; version 11) (Kumar et al., 2024). Sa faia le su'esu'ega o le evolusione e fa'aaoga ai le metotia o le maximum likelihood ma le general time-reversible nucleotide substitution model (Nei ma Kumar, 2000). O lo'o fa'aalia le la'au e sili ona maualuga le log-likelihood. O le la'au muamua mo le sailiga heuristic e filifilia e ala i le filifilia o le la'au e sili atu le maualuga o le log-likelihood i le va o le la'au neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) ma le la'au maximum parsimony (MP). O le la'au NJ na fausia e fa'aaoga ai se pairwise distance matrix na fuafuaina e fa'aaoga ai le general time-reversible model (Nei ma Kumar, 2000).
O le malosi fa'asaga i siama o le L-ornithine ma le vaila'au fa'amate siama "Rizolex-T" na fuafuaina i totonu o le vitro e ala i le metotia o le fa'asalalauina o le agar. Metotia: Ave le aofa'i talafeagai o le vai fa'aputu o le L-ornithine (500 mg/L) ma fa'afefiloi lelei ma le 10 ml o le PDA nutrient medium e saunia ai ni vai fa'atasi ai ma le maualuga mulimuli o le 12.5, 25, 50, 75, 100 ma le 125 mg/L, i le faasologa lava lea. E lima le maualuga o le fungicide "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 ma le 10 mg/L) ma le vai mama na fa'aaogaina e fai ma fa'atonutonu. Ina ua mae'a ona fa'ama'a'a le medium, o se mycelial plug fou ua saunia o le Sclerotinia sclerotiorum culture, 4 mm le lautele, na fa'aliliuina i le ogatotonu o le Petri dish ma totoina i le 25±2°C se'ia o'o ina ufiufi e le mycelium le Petri dish atoa, ma mulimuli ane na fa'amaumauina ai le tuputupu a'e o le fungal. Fuafua le pasene o le fa'alavelaveina o le tuputupu a'e radial o le S. sclerotiorum e fa'aaoga ai le fua fa'atatau 1:
Sa toe faia faalua le faataitaiga, faatasi ai ma ni toe faia o vailaau e ono mo vaega taitasi o le vaega pulea/faata'ita'i ma ni ulo e lima (la'au e lua i le ulo) mo toe faia o vailaau taitasi. Sa iloiloina faalua ia toe faia o vailaau taitasi (toe faia faatekinolosi e lua) ina ia mautinoa le sa'o, faatuatuaina ma le mafai ona toe faia o taunuuga o faataitaiga. E le gata i lea, sa faaaogaina le auiliiliga o le probit regression e fuafua ai le afa-maualuga o le inhibitory concentration (IC50) ma le IC99 (Prentice, 1976).
Ina ia iloilo le gafatia o le L-ornithine i lalo o tulaga o le fale lau'ele'ele, e lua fa'ata'ita'iga sosoo o ulo na faia. I se fa'apu'upu'u, na fa'atumuina ulo i le eleele oneone-omea ua fa'amamāina (3:1) ma fa'asusuina i se fa'ato'aga fou saunia o le S. sclerotiorum. Muamua, o le isolate sili ona fa'alavelave o le S. sclerotiorum (isolate #3) na fa'atupuina e ala i le tipiina o le tasi sclerotium i le afa, tu'u fa'asaga i lalo i luga o se PDA ma fa'asusu i le 25°C i le pogisa faifai pea (24 itula) mo le 4 aso e fa'aosofia ai le tuputupu a'e o mycelial. Ona ave lea o ni agar plug e fa e 5 mm le lautele mai le pito i luma ma fa'asusu i le 100 kalama o se paluga saito ma le araisa (1:1, v/v) ma o fagu uma na fa'asusuina i le 25 ± 2 °C i lalo o le 12 itula o le malamalama/12 itula o le pogisa mo le 5 aso e fa'aosofia ai le fausiaina o sclerotia. O mea o lo'o i totonu o fagu uma na fa'afefiloi lelei ina ia mautinoa le tutusa a'o le'i fa'aopoopoina le eleele. Ona fa'aopoopo lea o le 100 kalama o le paluga o le 'oti'oti na fa'aputu i totonu o ulo ta'itasi e fa'amautinoa ai le tumau pea o le tele o siama. O ulo na fa'asusuina na fa'asūsūina e fa'agaoioi ai le tuputupu a'e o siama ma tu'u i totonu o le fale lau'ele'ele mo le 7 aso.
Ona lūlūina lea o fatu e lima o le ituaiga Giza 3 i totonu o ulo taʻitasi. Mo ulo na togafitia i le L-ornithine ma le vailaʻau faʻamaʻi Rizolex-T, o fatu na faʻamamāina na muamua faʻasusu mo le lua itula i se vai faʻafefiloi o vailaʻau e lua ma le faʻaputuga mulimuli o le IC99 e tusa ma le 250 mg/L ma le 50 mg/L, i le faasologa lava lea, ona faʻamago lea i le ea mo le tasi le itula aʻo leʻi lūlūina. I le isi itu, o fatu na faʻasusu i le vai mama e fai ma faʻataʻitaʻiga lelei. A maeʻa aso e 10, aʻo leʻi faʻasusuina muamua, na faʻamamago ia laʻau, ma na o ni laʻau se lua e totoe i totonu o ulo taʻitasi. E le gata i lea, ina ia mautinoa le aʻafia i le S. sclerotiorum, o ʻau o pi i le tulaga tutusa o le tuputupu aʻe (10 aso) na tipiina i nofoaga eseese e lua e faʻaaoga ai se scalpel ua faʻamamāina ma pe tusa ma le 0.5 g o le paluga o le bran na nonofo ai na tuʻuina i totonu o manuʻa taʻitasi, sosoo ai ma le maualuga o le susū e faʻaosofia ai le aʻafia ma le atinaʻeina o faʻamaʻi i laʻau uma na tui. Sa faapena foi ona faamanu'alia laau pulea ma tuu i totonu o le manu'a se aofaiga tutusa (0.5 kalama) o le paluga o le paluga mama, e le'i fa'aputuina, ma tausia i le maualuga o le susū e fa'ata'ita'i ai le siosiomaga mo le atina'eina o fa'ama'i ma ia mautinoa le tutusa i le va o vaega togafitiga.
Auala e Togafitia ai: Sa fa'asūsūina tama'i pi i le 500 ml o se vaila'au vai o le L-ornithine (250 mg/l) po'o le vaila'au fungicide Rizolex-T (50 mg/l) e ala i le fa'asūsūina o le eleele, ona toe faia lea o le togafitiga fa'atolu i le va o aso e 10. O vaega e togafitia i le placebo sa fa'asūsūina i le 500 ml o le vai mama. O togafitiga uma sa faia i lalo o tulaga o le fale lau'ele'ele (25 ± 2°C, 75 ± 1% le susu, ma le vaitaimi o le malamalama e 8 itula/16 itula le pogisa). O ulo uma sa fa'asūsūina i vaiaso ta'i lua ma togafitia i masina ta'itasi i se fa'apalaga NPK paleni (20-20-20, fa'atasi ai ma le 3.6% sulfur ma TE microelements; Zain Seeds, Aikupito) i le maualuga o le 3–4 g/l e ala i le fa'asūsūina o la'au e tusa ai ma fautuaga mo le ituaiga fa'apitoa ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa. Se'i vagana ua fa'ailoa mai, o laulaau matutua ua matua atoatoa (laulau lona 2 ma le 3 mai luga) na aoina mai fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi i le 72 itula talu ona mae'a togafitiga (hpt), fa'afefiloi, tu'ufa'atasia ma teuina i le -80 °C mo nisi su'esu'ega e aofia ai, ae le fa'atapula'aina i, le in situ histochemical localization o fa'ailoga o le oxidative stress, lipid peroxidation, enzymatic ma non-enzymatic antioxidants ma le fa'aalia o kene.
Sa iloiloina le malosi o le pipisi o le ele pa'epa'e i vaiaso ta'itasi i le 21 aso talu ona tui (dpi) e fa'aaoga ai le fua fa'atatau o le 1–9 (Supplementary Table S2) e fa'avae i luga o le fua fa'atatau o Petzoldt ma Dickson (1996) na toe fa'aleleia e Teran et al. (2006). I se aotelega, sa su'esu'eina 'au ma lālā o la'au pi e amata mai i le tulaga na tui ai e mulimuli ai i le alualu i luma o manu'a i luga o internodes ma nodes. Ona fuaina lea o le mamao o le manu'a mai le tulaga na tui ai i le tulaga pito mamao i luga o le 'au po'o le lālā ma tu'uina atu se togi o le 1–9 e fa'atatau i le nofoaga o le manu'a, lea (1) fa'aalia ai le leai o se fa'ama'i vaaia e lata ane i le tulaga na tui ai ma le (2–9) fa'aalia ai le fa'ateleina malie o le tele o manu'a ma le alualu i luma i luga o nodes/internodes (Supplementary Table S2). Ona liua lea o le malosi o le pipisi o le ele pa'epa'e i le pasene e fa'aaoga ai le fua fa'atatau 2:
E le gata i lea, o le vaega i lalo o le pi'o o le alualu i luma o le fa'ama'i (AUDPC) sa fuafuaina e fa'aaoga ai le fua fa'atatau (Shaner ma Finney, 1977), lea na fa'ato'ā fetu'una'i talu ai nei mo le pala pa'epa'e o pi masani (Chauhan et al., 2020) e fa'aaoga ai le fua fa'atatau 3:
O le Yi = le ogaoga o le faʻamaʻi i le taimi ti, Yi+1 = le ogaoga o le faʻamaʻi i le isi taimi ti+1, ti = le taimi o le fua muamua (i aso), ti+1 = le taimi o le fua e sosoo ai (i aso), n = le aofaʻi o taimi poʻo taimi e matauina ai. O faʻamaumauga o le tuputupu aʻe o laʻau pi e aofia ai le maualuga o le laʻau (cm), le aofaʻi o lālā i le laʻau, ma le aofaʻi o laulaau i le laʻau na faʻamaumauina i vaiaso taʻitasi mo le 21 aso i faʻataʻitaʻiga faʻaola uma.
I fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi, o fa'ata'ita'iga o lau (lau lona lua ma le lona tolu ua atoatoa ona atia'e mai luga) na aoina i le aso 45 ina ua mae'a togafitiga (15 aso talu ona mae'a togafitiga mulimuli). O fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi e aofia ai ulo e lima (la'au e lua i le ulo). E tusa ma le 500 mg o le a'ano na nutililiiina na fa'aaogaina mo le aveeseina o pigments photosynthetic (chlorophyll a, chlorophyll b ma carotenoids) e fa'aaoga ai le 80% acetone i le 4 °C i le pogisa. A mae'a le 24 itula, na fa'asolo ai fa'ata'ita'iga ma aoina le supernatant mo le fuafuaina o le chlorophyll a, chlorophyll b ma le carotenoid contents colorimetrically e fa'aaoga ai le UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Iapani) e tusa ai ma le metotia o le (Lichtenthaler, 1987) e ala i le fuaina o le absorbance i galu eseese e tolu (A470, A646 ma le A663 nm). Mulimuli ane, o le aofa'i o pigments photosynthetic na fuafuaina e fa'aaoga ai fua fa'atatau nei 4–6 na fa'amatalaina e Lichtenthaler (1987).
I le 72 itula talu ona maeʻa le togafitiga (hpt), na aoina ai laulaau (laulau lona lua ma le lona tolu ua atoatoa ona atiaʻe mai luga) mai faʻataʻitaʻiga faʻaola taʻitasi mo le faʻavasegaina o le hydrogen peroxide (H2O2) ma le superoxide anion (O2•−). O faʻataʻitaʻiga faʻaola taʻitasi e aofia ai ulo e lima (laʻau e lua i le ulo). O faʻataʻitaʻiga faʻaola taʻitasi na suʻesuʻeina i ni kopi (faʻataʻitaʻiga faʻapitoa e lua) e faʻamautinoa ai le saʻo, faʻatuatuaina ma le toe gaosia o le metotia. O le H2O2 ma le O2•− na fuafuaina e faʻaaoga ai le 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Siamani) poʻo le nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Siamani), i le mulimuli ai i metotia na faʻamatalaina e Romero-Puertas et al. (2004) ma Adam et al. (1989) faʻatasi ai ma ni nai suiga laiti. Mo le fa'avasegaina o le H2O2 i totonu, na fa'asusuina pepa laiti i le 0.1% DAB i le 10 mM Tris buffer (pH 7.8) ona fa'asusu lea i le vevela o le potu i le malamalama mo le 60 minute. Na fa'apa'epa'eina pepa laiti i le 0.15% (v/v) TCA i le 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ona fa'aalia lea i le malamalama se'ia pogisa. I se tulaga tutusa, na fa'asusuina valves i le 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) o lo'o i ai le 0.1 w/v % HBT mo le fa'avasegaina o le O2•− i totonu. Na fa'asusuina pepa laiti i le malamalama i le vevela o le potu mo le 20 minute, ona fa'apa'epa'eina lea e pei ona ta'ua i luga, ona fa'amalamalamaina lea se'ia aliali mai ni ila lanumoana/violet pogisa. O le malosi o le lanu enaena (e fai ma fa'ailoga H2O2) po'o le lanumoana-violet (e fai ma fa'ailoga O2•−) na iloiloina e fa'aaoga ai le lomiga Fa'a-Fiji o le afifi fa'agasologa ata ImageJ (http://fiji.sc; na maua i le aso 7 Mati 2024).
O le Malondialdehyde (MDA; o se fa'ailoga o le lipid peroxidation) na fuafuaina e tusa ai ma le metotia a Du ma Bramlage (1992) fa'atasi ai ma ni nai suiga laiti. O lau mai fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi (lau lona lua ma le lona tolu ua atoatoa ona atia'e mai luga) na aoina i le 72 itula talu ona mae'a togafitiga (hpt). O fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi e aofia ai ulo e lima (la'au e lua i le ulo). O fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi na su'esu'eina i ni kopi (fa'ata'ita'iga fa'atekinolosi e lua) e fa'amautinoa ai le sa'o, fa'atuatuaina ma le toe gaosia o le metotia. I se aotelega, 0.5 g o le aano o lau na eleele na fa'aaogaina mo le MDA extraction ma le 20% trichloroacetic acid (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, ISA) o lo'o i ai le 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ISA). Ona fuafuaina lea o le aofaʻi o le MDA i totonu o le supernatant i le lanu e ala i le fuaina o le absorbance i le 532 ma le 600 nm e faʻaaoga ai le UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Iapani) ona faʻaalia lea o le nmol g−1 FW.
Mo le iloiloga o antioxidants e le o ni enzyme ma enzyme, o laulaau (laulau lona lua ma le lona tolu ua atoatoa ona atia'e mai luga) na aoina mai fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi i le 72 itula talu ona mae'a togafitiga (hpt). O fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi e aofia ai ulo e lima (la'au e lua i le ulo). O fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi na su'esu'eina fa'alua (fa'ata'ita'iga fa'apitoa e lua). E lua laulaau na oloina i le nitrogen vai ma fa'aaoga sa'o mo le fuafuaina o antioxidants enzymatic ma non-enzymatic, aofa'i o amino acids, aofa'i o proline, fa'aaliga o gene, ma le fuaina o le oxalate.
Sa fuafuaina le aofaʻi o phenolics soluble e faʻaaoga ai le Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ISA) faʻatasi ai ma ni suiga laiti o le metotia na faʻamatalaina e Kahkonen et al. (1999). I se aotelega, e tusa ma le 0.1 kalama o le aano o laulaau ua faʻafefiloi na aveeseina i le 20 ml 80% methanol i le pogisa mo le 24 itula ma aoina le supernatant ina ua maeʻa le centrifugation. 0.1 ml o le sample extract na palu faʻatasi ma le 0.5 ml Folin-Ciocalteu reagent (10%), lūlūina mo le 30 sekone ma tuʻu i le pogisa mo le 5 minute. Ona faʻaopoopo lea o le 0.5 ml o le 20% sodium carbonate solution (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) i fagu taʻitasi, palu faʻatasi ma le lelei ma faʻasusu i le vevela o le potu i le pogisa mo le 1 itula. A maeʻa ona faʻasusu, ona fuaina lea o le mitiia o le paluga o le tali i le 765 nm e faʻaaoga ai le UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Iapani). O le maualuga o le aofaʻi o phenols soluble i totonu o faʻataʻitaʻiga na fuafuaina e faʻaaoga ai le gallic acid calibration curve (Fisher Scientific, Hampton, NH, ISA) ma faʻaalia o milligrams o le gallic acid equivalent i le kalama o le mamafa fou (mg GAE g-1 mamafa fou).
O le aofaʻi atoa o le flavonoid soluble sa fuafuaina e tusa ai ma le metotia a Djeridane et al. (2006) faʻatasi ai ma ni nai suiga laiti. I se aotelega, o le 0.3 ml o le methanol extract o loʻo i luga sa palu faʻatasi ma le 0.3 ml o le 5% aluminum chloride solution (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ISA), faʻagaeʻe malosi ona faʻasusu lea i le vevela o le potu mo le 5 minute, sosoo ai ma le faʻaopoopoina o le 0.3 ml o le 10% potassium acetate solution (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), faʻafefiloi lelei ma faʻasusu i le vevela o le potu mo le 30 minute i le pogisa. A maeʻa le faʻasusu, o le mitiia o le paluga tali atu sa fuaina i le 430 nm e faʻaaoga ai le UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Iapani). O le maualuga o le aofaʻi atoa o flavonoids soluble i totonu o faʻataʻitaʻiga sa fuafuaina e faʻaaoga ai le rutin calibration curve (TCI America, Portland, OR, ISA) ona faʻaalia lea o milligrams o le rutin equivalent i le gram o le mamafa fou (mg RE g-1 mamafa fou).
O le aofaʻi atoa o le amino acid saoloto o laulaau pi na fuafuaina e faʻaaoga ai le ninhydrin reagent ua suia (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ISA) e faʻavae i luga o le metotia na fautuaina e Yokoyama ma Hiramatsu (2003) ma suia e Sun et al. (2006). I se aotelega, 0.1 kalama o le aano o le tino na aveeseina i le pH 5.4 buffer, ma 200 μL o le supernatant na faʻafefiloi ma le 200 μL o le ninhydrin (2%) ma le 200 μL o le pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, ISA), faʻasusu i totonu o se vai pupuna mo le 30 minute, ona faʻamālūlūina lea ma fuaina i le 580 nm e faʻaaoga ai le UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Iapani). I le isi itu, o le proline na fuafuaina e ala i le metotia a Bates (Bates et al., 1973). Sa fa'a'ese'ese le Proline i le 3% sulfosalicylic acid (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ISA) ma ina ua mae'a ona fa'a'ese'ese, sa fa'afefiloi le 0.5 ml o le supernatant ma le 1 ml glacial acetic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, ISA) ma le ninhydrin reagent, fa'a'ese'ese i le 90°C mo le 45 minute, fa'amālūlūina ma fuaina i le 520 nm e fa'aaoga ai le spectrophotometer lava e tasi e pei ona ta'ua i luga. O le aofa'i o amino acids saoloto ma le proline i totonu o laulaau sa fuafuaina e fa'aaoga ai le glycine ma le proline calibration curves (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ISA), ma fa'aalia i le mg/g o le mamafa fou.
Ina ia iloa le gaioiga fa'aenzymatic o enzymes antioxidant, e tusa ma le 500 mg o le aano homogenized na aveeseina i le 3 ml o le 50 mM Tris buffer (pH 7.8) o lo'o i ai le 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ISA) ma le 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ISA), centrifuged i le 10,000 × g mo le 20 minute i lalo o le fa'amālūlūina (4 °C), ma aoina le supernatant (crude enzyme extract) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ona fa'afefiloi lea o le Catalase (CAT) ma le 2 ml o le 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ma le 100 μl o le 269 mM H2O2 solution e iloa ai lona gaioiga enzymatic e tusa ai ma le metotia a Aebi (1984) fa'atasi ai ma ni nai suiga laiti (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). O le gaioiga enzymatic a le Guaiacol-dependent peroxidase (POX) na iloa ai e fa'aaoga ai le metotia a Harrach et al. (2009). (2008) faatasi ai ma ni nai suiga laiti (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ma le gaioiga enzymatic o le polyphenol oxidase (PPO) na fuafuaina ina ua maeʻa le tali atu ma le 2.2 ml o le 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), 100 μl o le guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) ma le 100 μl o le 12 mM H2O2. O le metotia na suia teisi mai le (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). O le suʻega na faia ina ua maeʻa le tali atu ma le 3 ml o le catechol solution (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) na saunia fou i le 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). Sa fuaina le gaioiga a le CAT e ala i le mata'ituina o le fa'aleagaina o le H2O2 i le 240 nm (A240), sa fuaina le gaioiga a le POX e ala i le mata'ituina o le fa'ateleina o le absorbance i le 436 nm (A436), ma sa fuaina le gaioiga a le PPO e ala i le fa'amaumauina o suiga o le absorbance i le 495 nm (A495) i le 30 sekone uma mo le 3 minute e fa'aaoga ai le UV-160A spectrophotometer (Shimadzu, Iapani).
Sa fa'aaogaina le Real-time RT-PCR e iloa ai le tulaga o le transcript o ni genes e tolu e feso'ota'i ma le antioxidant, e aofia ai le peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), ma le glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), i laulaau pi (o laulaau lona lua ma le lona tolu ua atoatoa ona atia'e mai luga) 72 itula talu ona mae'a le togafitiga mulimuli. I se faapuupuuga, sa vavae'eseina le RNA e fa'aaoga ai le Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Saina) e tusa ai ma le protocol a le kamupani gaosi. Ona fa'aputuina lea o le cDNA e fa'aaoga ai le TOP script™ cDNA Synthesis Kit e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi. O fa'asologa o primer o genes e tolu o lo'o i luga o lo'o lisiina i le Supplementary Table S3. Sa fa'aaogaina le PvActin-3 (numera o le GenBank accession: XM_068616709.1) o le housekeeping gene ma sa fuafuaina le fa'aalia o le gene fa'atatau e fa'aaoga ai le metotia 2-ΔΔCT (Livak ma Schmittgen, 2001). Sa fa'aalia le mautu o le Actin i lalo o le biotic stress (feso'ota'iga le fetaui i le va o legumes masani ma le anthracnose fungus Colletotrichum lindemuthianum) ma le abiotic stress (lamala, masima, vevela maualalo) (Borges et al., 2012).
Na matou faia muamua se su'esu'ega genome-lautele i le silico o polotini oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) i le S. sclerotiorum e fa'aaoga ai le meafaigaluega BLAST protein-protein (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). I se aotelega, na matou fa'aaogaina le OAH mai le Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) ma le Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 amino acids) o ni fa'asologa o fesili e fa'afanua ai le homologous protein i le S. sclerotiorum (taxide: 5180). Sa faia le BLASTp e fa'atatau i fa'amaumauga lata mai o le genome o le S. sclerotiorum i le GenBank i luga o le upega tafa'ilagi a le National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
E le gata i lea, o le gene OAH ua valoia mai le S. sclerotiorum (SsOAH) ma le auiliiliga o le evolusione ma le laau phylogenetic o le AfOAH mai le A. fijiensis CBS 313.89 ma le PlOAH mai le P. lagena na faʻatatauina e faʻaaoga ai le metotia aupito maualuga o le mafai i le MEGA11 (Tamura et al., 2021) ma le faʻataʻitaʻiga faʻavae i luga o le matrix JTT (Jones et al., 1992). O le laau phylogenetic na tuʻufaʻatasia ma le auiliiliga tele o le faʻatulagaina o faʻasologa o porotini o gene OAH uma ua valoia (SsOAH) mai le S. sclerotiorum ma le faʻasologa o fesili e faʻaaoga ai le Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ma Agarwala, 2007). E le gata i lea, o fa'asologa sili ona fetaui o amino acid o le SsOAH mai le S. sclerotiorum sa fa'atulagaina ma fa'asologa o fesili (AfOAH ma PlOAH) (Larkin et al., 2007) e fa'aaoga ai le ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ma o vaega fa'asao i le fa'atulagaina sa fa'aalia e fa'aaoga ai le meafaigaluega ESPript (lomiga 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
E le gata i lea, o vaega fa'atino ma nofoaga fa'asao o le S. sclerotiorum SsOAH sa fa'avasegaina fa'atasi i ni aiga eseese e fa'aaoga ai le meafaigaluega InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Mulimuli ane, o le fa'ata'ita'iga o le fausaga tolu-vaega (3D) o le S. sclerotiorum SsOAH sa fa'atinoina e fa'aaoga ai le Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ma fa'amaonia e fa'aaoga ai le SWISS-MODEL server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). O fausaga e tolu-vaega na valoia (faatulagaga PDB) sa vaaia fa'atasi e fa'aaoga ai le afifi UCSF-Chimera (lomiga 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Sa fa'aaogaina le quantitative real-time fluorescence PCR e iloa ai le tulaga fa'aliliu o le oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) i totonu o le mycelia o Sclerotinia sclerotiorum. I se faapuupuuga, sa fa'asusuina le S. sclerotiorum i totonu o se fagu o lo'o i ai le PDB ma tu'u i totonu o se incubator lulu (fa'ata'ita'iga: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) i le 25 ± 2 °C mo le 24 itula i le 150 rpm ma i le pogisa faifai pea (24 itula) e fa'aosofia ai le tuputupu a'e o le mycelial. Ina ua mae'a lena, sa togafitia sela i le L-ornithine ma le fungicide Rizolex-T i le maualuga mulimuli o le IC50 (pe tusa ma le 40 ma le 3.2 mg/L, i le faasologa) ona toe totoina lea mo le isi 24 itula i lalo o tulaga lava e tasi. A maeʻa ona faʻasusu, ona faʻasolo lea o faʻatoʻaga i le 2500 rpm mo le 5 minute ma aoina le supernatant (fungal mycelium) mo le suʻesuʻeina o le faʻaalia o kene. I se tulaga tutusa, na aoina le fungal mycelium i le 0, 24, 48, 72, 96, ma le 120 itula talu ona aʻafia i le faʻamaʻi mai laʻau ua aʻafia na fausia ai le limu paʻepaʻe ma le cottony mycelium i luga o aʻano ua aʻafia. Na aveeseina le RNA mai le fungal mycelium ona faʻapipiʻiina lea o le cDNA e pei ona faʻamatalaina i luga. O faʻasologa o le primer mo le SsOAH o loʻo lisiina i le Supplementary Table S3. SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) na faʻaaogaina o le housekeeping gene, ma o le faʻaalia o kene faʻatatau na fuafuaina e faʻaaoga ai le metotia 2-ΔΔCT (Livak ma Schmittgen, 2001).
Sa fuafuaina le oxalic acid i le supo pateta dextrose (PDB) ma faʻataʻitaʻiga o laʻau o loʻo i ai le siama fungal Sclerotinia sclerotiorum e tusa ai ma le metotia a Xu ma Zhang (2000) faʻatasi ai ma ni nai suiga laiti. I se aotelega, o S. sclerotiorum isolates na faʻasusuina i totonu o fagu o loʻo i ai le PDB ona faʻatupuina lea i totonu o se incubator lulu (faʻataʻitaʻiga I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ISA) i le 150 rpm i le 25 ± 2 °C mo le 3–5 aso i le pogisa faifai pea (24 itula) e faʻaosofia ai le tuputupu aʻe o le mycelial. A maeʻa ona faʻatupuina, na muamua faʻamamāina le faʻatoʻaga fungal i le pepa faʻamamā Whatman #1 ona faʻacentrifuge lea i le 2500 rpm mo le 5 minute e aveese ai le mycelium o totoe. Na aoina le supernatant ma teuina i le 4°C mo le faʻamautinoaina atili o le oxalate. Mo le sauniaina o faʻataʻitaʻiga o laʻau, e tusa ma le 0.1 g o vaega o le aano o laʻau na faʻaosoina faatolu i le vai faʻamamā (2 ml i taimi taʻitasi). Ona fa'acentrifuge lea o fa'ata'ita'iga i le 2500 rpm mo le 5 minute, ona fa'amama mago lea o le supernatant i le pepa fa'amama Whatman No. 1 ma aoina mo nisi su'esu'ega.
Mo le su'esu'ega fa'atatau o le oxalic acid, sa saunia le paluga o le tali i totonu o se paipa tioata ua tapuni i le fa'asologa lenei: 0.2 ml o le fa'ata'ita'iga (po'o le PDB culture filtrate po'o le oxalic acid standard solution), 0.11 ml o le bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, ISA), 0.198 ml o le 1 M sulfuric acid (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ma le 0.176 ml o le 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, ISA), ona fa'afefiloi lea o le tali i le 4.8 ml i le vai fa'amamā, fa'afefiloi malosi ma tu'u loa i totonu o se vai ta'ele e 60 °C. A mae'a le 10 minute, ona taofia lea o le tali i le fa'aopoopoina o le 0.5 ml o le sodium hydroxide solution (NaOH; 0.75 M). O le mitiia (A600) o le paluga tali na fuaina i le 600 nm e faʻaaoga ai le UV-160 spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Iapani). O le PDB ma le vai faʻamamāina na faʻaaogaina o ni faʻatonutonu mo le fuaina o faʻamamāina o laʻau ma faʻataʻitaʻiga o laʻau. O le maualuga o le oxalic acid i totonu o faʻamamāina o laʻau, o loʻo faʻaalia o ni micrograms o le oxalic acid i le milliliter o le PDB medium (μg.mL−1), ma i totonu o laulaau, o loʻo faʻaalia o ni micrograms o le oxalic acid i le gram o le mamafa fou (μg.g−1 FW), na fuafuaina e faʻaaoga ai le oxalic acid calibration curve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ISA).
I le suʻesuʻega atoa, o faʻataʻitaʻiga uma na mamanuina i se mamanu faʻafuaseʻi atoatoa (CRD) ma ono faʻataʻitaʻiga faʻaola i togafitiga taʻitasi ma le lima ulo i le faʻataʻitaʻiga faʻaola (lua laʻau i le ulo) seʻi vagana ua faʻailoa mai. O faʻataʻitaʻiga faʻaola na suʻesuʻeina faʻalua (lua faʻataʻitaʻiga faʻapitoa). Na faʻaaogaina faʻataʻitaʻiga faʻapitoa e siaki ai le toe gaosia o le faʻataʻitaʻiga lava e tasi ae leʻi faʻaaogaina i le auʻiliʻiliga faʻamaumauga e ʻalofia ai faʻataʻitaʻiga sese. Na auʻiliʻili faʻamaumauga faʻamaumauga e faʻaaoga ai le auʻiliʻiliga o le eseesega (ANOVA) sosoo ai ma le suʻega eseesega taua a Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). Mo faʻataʻitaʻiga in vitro, na fuafuaina ai tau o le IC50 ma le IC99 e faʻaaoga ai le faʻataʻitaʻiga probit ma fuafuaina ai le 95% o vaeluaga o le talitonuga.
E fa ni vaega na aoina mai ni togālaau soya eseese i le Itumalo o El Ghabiya, Aikupito. I luga o le PDA medium, o vaega uma na gaosia ai ni mycelium paʻepaʻe kulimi lea na vave ona liu paʻepaʻe e pei o le vavae (Ata 1A) ona sosoo ai lea ma le beige poʻo le enaena i le tulaga o le sclerotium. O Sclerotia e masani ona mafiafia, uliuli, lapotopoto pe le tutusa foʻi foliga, e 5.2 i le 7.7 mm le umi ma le 3.4 i le 5.3 mm le lautele (Ata 1B). E ui lava e fa ni vaega na atiaʻe se mamanu o le sclerotia i autafa o le auala totoina ina ua mavae aso e 10–12 o le faʻasusuina i le 25 ± 2 °C (Ata 1A), o le aofaʻi o sclerotia i le ipu e tasi sa matuā eseese lava i le va o i latou (P < 0.001), ma o le vaega 3 e sili ona tele le aofaʻi o sclerotia (32.33 ± 1.53 sclerotia i le ipu e tasi; Ata 1C). E fa'apena fo'i, o le isolate #3 na maua ai le tele o le oxalic acid i le PDB nai lo isi isolates (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Ata 1D). O le Isolate #3 na fa'aalia ai uiga masani o le morphology ma le microscopic o le phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum. Mo se fa'ata'ita'iga, i le PDA, na vave ona tupu a'e kolone o le isolate #3, e pa'epa'e kulimi (Ata 1A), e lanu beige pe samasama-enaena vaivai, ma e mana'omia le 6-7 aso i le 25 ± 2°C e ufiufi atoa ai le fogā'ele'ele o se ipu e 9 cm le lautele. E fa'atatau i uiga o le morphology ma le microscopic o lo'o i luga, na fa'ailoa mai ai le isolate #3 o le Sclerotinia sclerotiorum.
Ata 1. Uiga ma le fa'ama'i o le S. sclerotiorum isolates mai fa'ato'aga legume masani. (A) Tuputupu a'e o le mycelial o le fa o le S. sclerotiorum isolates i luga o le PDA medium, (B) sclerotia o le fa o le S. sclerotiorum isolates, (C) numera o le sclerotia (i le ipu), (D) o le oxalic acid secretion i luga o le PDB medium (μg.mL−1), ma le (E) ogaoga o fa'ama'i (%) o le fa o le S. sclerotiorum isolates i luga o le Giza 3 fa'apisinisi e vaivai i lalo o tulaga o le greenhouse. O tau e fa'atusalia ai le averesi ± SD o le lima fa'ata'ita'iga fa'aola (n = 5). O mata'itusi eseese e fa'ailoa mai ai eseesega taua fa'amau'a i le va o togafitiga (p < 0.05). (F–H) O fa'ailoga masani o le limu pa'epa'e na aliali mai i luga o ogalaau ma siliques i luga o le eleele, i le 10 aso talu ona fa'ainu i le isolate #3 (dpi). (I) O le su'esu'ega o le evolusione o le vaega o le internal transcribed spacer (ITS) o le S. sclerotiorum isolate #3 na faia e fa'aaoga ai le metotia o le maximum likelihood ma fa'atusatusa i le 20 reference isolates/strains na maua mai le National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). O numera i luga a'e o laina clustering e fa'ailoa mai ai le ufiufi o le itulagi (%), ma o numera i lalo ifo o laina clustering e fa'ailoa mai ai le umi o le lālā.
E le gata i lea, ina ia faʻamaonia le faʻamaʻi, e fa ni vaega o le S. sclerotiorum na maua na faʻaaogaina e tui ai le ituaiga pi faʻapisinisi vaivai o le Giza 3 i lalo o tulaga o le fale lauʻeleʻele, lea e ogatasi ma poutū a Koch (Ata 1E). E ui o vaega uma o le fungal na maua e faʻamaʻi ma e mafai ona aʻafia ai le pi lanumeamata (cv. Giza 3), ma mafua ai faʻailoga masani o le popole paʻepaʻe i vaega uma i luga o le eleele (Ata 1F), aemaise lava i luga o ogalaau (Ata 1G) ma fatu (Ata 1H) i le 10 aso talu ona tui (dpi), o le vaega 3 o le vaega sili ona malosi i faʻataʻitaʻiga tutoʻatasi e lua. O le vaega 3 na sili ona ogaoga le faʻamaʻi (%) i laʻau pi (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, ma le 76.7 ± 3.1 i le 7, 14, ma le 21 aso talu ona aʻafia, i le faasologa; Ata 1F).
O le fa'ailoaina o le S. sclerotiorum isolate #3 e sili ona fa'alavelave na toe fa'amaonia e fa'avae i luga o le fa'asologa o le internal transcribed spacer (ITS) (Ata 1I). O le su'esu'ega phylogenetic i le va o le isolate #3 ma le 20 reference isolates/strains na fa'aalia ai le tutusa tele (>99%) i le va o latou. E taua le maitauina o le S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) e maualuga le tutusa ma le American S. sclerotiorum isolate LPM36 na vavae'ese mai fatu pi mago (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) ma le Chinese S. sclerotiorum isolate YKY211 (GenBank accession number OR206374.1; 548 bp), lea e mafua ai le pala o le ogalaau violet (Matthiola incana), o ia mea uma e fa'aputuina eseese i le pito i luga o le dendrogram (Ata 1I). Ua teuina le fa'asologa fou i le fa'amaumauga a le NCBI ma ua faaigoaina o le “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792). E mafai ona iloa o le isolate 3 o le isolate sili ona fa'alavelave; o le mea lea, na filifilia ai lenei isolate mo su'esu'ega i fa'ata'ita'iga uma na mulimuli mai.
O le malosi fa'asaga i siama o le diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Siamani) i le tele o vaega eseese (12.5, 25, 50, 75, 100 ma le 125 mg/L) e fa'asaga i le S. sclerotiorum isolate 3 na su'esu'eina i totonu o le vitro. E taua le maitauina o le L-ornithine na fa'aalia ai se aafiaga fa'asaga i siama ma fa'asolosolo malie ona taofia le tuputupu a'e o le S. sclerotiorum hyphae i se auala e fa'alagolago i le fua (Ata 2A, B). I le maualuga o le malosi na fa'ata'ita'iina (125 mg/L), na fa'aalia ai e le L-ornithine le maualuga o le fua fa'atatau o le taofia o le tuputupu a'e o le mycelial (99.62 ± 0.27%; Ata 2B), lea e tutusa ma le fungicide fa'apisinisi Rizolex-T (fua fa'atatau o le taofia 99.45 ± 0.39%; Ata 2C) i le maualuga o le malosi na fa'ata'ita'iina (10 mg/L), e fa'aalia ai le aoga tutusa.
Ata 2. Gaoioiga fa'a-antibacterial in vitro o le L-ornithine e fa'asaga i le Sclerotinia sclerotiorum. (A) Fa'atusatusaga o le gaioiga fa'a-antibacterial o le tele eseese o le L-ornithine e fa'asaga i le S. sclerotiorum ma le fungicide fa'apisinisi Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Saosaoa fa'alavelave (%) o le tuputupu a'e o le mycelial o le S. sclerotiorum pe a uma togafitiga ma le tele eseese o le L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 ma le 125 mg/L) po'o le Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ma le 10 mg/L), i le fa'asologa. O tau e fa'atusalia ai le averesi ± SD o fa'ata'ita'iga fa'aola e lima (n = 5). O mata'itusi eseese e fa'ailoa mai ai eseesega fa'amaumauga i le va o togafitiga (p < 0.05). (D, E) Su'esu'ega fa'asolosolo o le fa'ata'ita'iga Probit o le L-ornithine ma le fungicide fa'apisinisi Rizolex-T, i le fa'asologa. O le laina regression o le probit model ua faʻaalia o se laina lanumoana mafiafia, ma o le confidence interval (95%) ua faʻaalia o se laina mumu manifinifi.
E le gata i lea, sa faia le su'esu'ega o le probit regression ma o lo'o fa'aalia ata fa'atatau i le Laulau 1 ma Ata 2D,E. I se aotelega, o le tau o le slope taliaina (y = 2.92x − 4.67) ma fuainumera taua e feso'ota'i (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ma le p < 0.0001; Ata 2D) o le L-ornithine na fa'aalia ai se gaioiga fa'amalosia o le antifungal e fa'asaga i le S. sclerotiorum pe a fa'atusatusa i le fungicide fa'apisinisi Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ma le p < 0.0001) (Laulau 1).
Laulau 1. Tau o le afa-maualuga o le malosi fa'asaina (IC50) ma le IC99 (mg/l) o le L-ornithine ma le vaila'au fa'asaina fa'apisinisi "Rizolex-T" e fa'asaga i le S. sclerotiorum.
I le aotelega, o le L-ornithine (250 mg/L) na faʻaitiitia ai le atinaʻeina ma le ogaoga o le popole paʻepaʻe i laʻau pi masani na togafitia pe a faʻatusatusa i laʻau na aʻafia i le S. sclerotiorum e leʻi togafitia (pulea; Ata 3A). I ​​se aotelega, e ui lava ina faʻasolosolo ona faʻateleina le ogaoga o faʻamaʻi o laʻau pulea na aʻafia e leʻi togafitia (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ma le 92.33 ± 3.06%), ae na faʻaitiitia tele e le L-ornithine le ogaoga o le faʻamaʻi (%) i le taimi atoa o le faʻataʻitaʻiga (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ma le 26.36 ± 3.07) i le 7, 14, ma le 21 aso talu ona maeʻa togafitiga (dpt), i le faasologa (Ata 3A). E fa’apena fo’i, ina ua togafitia la’au pi ua a’afia i le S. sclerotiorum i le 250 mg/L L-ornithine, o le vaega i lalo o le pi’o o le alualu i luma o le fa’ama’i (AUDPC) na fa’aitiitia mai le 1274.33 ± 33.13 i le vaega e le’i togafitia i le 281.03 ± 7.95, lea e maualalo teisi nai lo le vaega lelei o le 50 mg/L Rizolex-T fungicide (183.61 ± 7.71; Ata 3B). O le aga lava lea e tasi na matauina i le fa’ata’ita’iga lona lua.
Ata 3. A'afiaga o le fa'aogaina o le L-ornithine mai fafo i le atina'eina o le pala pa'epa'e o pi masani e mafua mai i le Sclerotinia sclerotiorum i lalo o tulaga fa'a-greenhouse. (A) Pi'o o le alualu i luma o le fa'ama'i o le ele pa'epa'e o pi masani pe a uma ona togafitia i le 250 mg/L L-ornithine. (B) Vaega i lalo o le pi'o o le alualu i luma o le fa'ama'i (AUDPC) o le ele pa'epa'e o pi masani pe a uma ona togafitia i le L-ornithine. O tau e fa'atusalia ai le averesi ± SD o fa'ata'ita'iga fa'aola e lima (n = 5). O mata'itusi eseese e fa'ailoa mai ai eseesega taua fa'amau'a i le va o togafitiga (p < 0.05).
O le fa'aaogaina mai fafo o le 250 mg/L L-ornithine na fa'asolosolo malie ona fa'ateleina le maualuga o le la'au (Ata 4A), le aofa'i o lālā i le la'au (Ata 4B), ma le aofa'i o lau i le la'au (Ata 4C) ina ua mavae aso e 42. E ui o le fungicide fa'apisinisi Rizolex-T (50 mg/L) na sili ona a'afia ai fa'amatalaga tau mea'ai uma na su'esu'eina, o le fa'aaogaina mai fafo o le 250 mg/L L-ornithine na sili ona a'afia ai pe a fa'atusatusa i vaega e le'i togafitia (Ata 4A–C). I le isi itu, o le togafitiga o le L-ornithine e leai se a'afiaga tele i le aofa'i o pigments photosynthetic chlorophyll a (Ata 4D) ma le chlorophyll b (Ata 4E), ae na fa'ateleina teisi le aofa'i o le carotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) pe a fa'atusatusa i le vaega e le'i lelei (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) ma le vaega e lelei (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Ata 4F). I le aotelega, o nei taunuuga e faʻaalia ai e le oona le L-ornithine i pi ua togafitia ma e ono faʻaosofia ai foʻi lo latou tuputupu aʻe.
Ata 4. Aafiaga o le fa'aogaina o le L-ornithine mai fafo i uiga o le tuputupu a'e ma lanu fa'aolaola o laulaau pi ua a'afia i le Sclerotinia sclerotiorum i lalo o tulaga fa'aolaola. (A) Maualuga o le la'au (cm), (B) Numera o lālā i le la'au, (C) Numera o laulaau i le la'au, (D) Aotelega o le Chlorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) Aotelega o le Chlorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) Aotelega o le carotenoid (mg g-1 fr wt). O tau o le averesi ± SD o fa'ata'ita'iga fa'aolaola e lima (n = 5). O mata'itusi eseese e fa'ailoa mai ai eseesega taua fa'amau'a i le va o togafitiga (p < 0.05).
O le in situ histochemical localization o reactive oxygen species (ROS; ua fa'aalia o le hydrogen peroxide [H2O2]) ma free radicals (ua fa'aalia o le superoxide anions [O2•−]) na fa'aalia ai o le fa'aogaina i fafo o le L-ornithine (250 mg/L) na fa'aitiitia ai le fa'aputuga o le H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Ata 5A) ma le O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Ata 5B) pe a fa'atusatusa i le fa'aputuga o la'au ua a'afia e le'i togafitia (173.31 ± 12.06 ma le 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, i le fa'asologa) ma la'au na togafitia i le 50 mg/L o le fungicide fa'apisinisi Rizolex-T (170.12 ± 9.50 ma le 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, i le fa'asologa) i le 72 itula. O le maualuga o le H2O2 ma le O2•− na faaputuputuina i lalo o le hpt (Ata 5A, B). I se tulaga tutusa, o le suʻega malondialdehyde (MDA) e faʻavae i luga o le TCA na faʻaalia ai o laʻau pi na aʻafia i le S. sclerotiorum na faaputuputuina le maualuga o le MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) i o latou lau (Ata 5C). Peitaʻi, o le faʻaaogaina o le L-ornithine i fafo na faʻaitiitia ai le lipid peroxidation e pei ona faʻamaonia e le faʻaitiitia o le aofaʻi o le MDA i laʻau na togafitia (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Ata 5. A'afiaga o le fa'aogaina o le L-ornithine mai fafo i fa'ailoga autu o le atuatuvale o le oxidative ma faiga puipuia o le antioxidant e le o ni enzymatic i laulaau pi ua a'afia i le S. sclerotiorum i le 72 itula talu ona fa'ama'i i lalo o tulaga o le fale lau'ele'ele. (A) Hydrogen peroxide (H2O2; nmol g−1 FW) i le 72 hpt, (B) superoxide anion (O2•−; nmol g−1 FW) i le 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) i le 72 hpt, (D) aofa'i o phenols soluble (mg GAE g−1 FW) i le 72 hpt, (E) aofa'i o flavonoids soluble (mg RE g−1 FW) i le 72 hpt, (F) aofa'i o amino acids saoloto (mg g−1 FW) i le 72 hpt, ma le (G) aofa'i o proline (mg g−1 FW) i le 72 hpt. O tau e faʻatusalia ai le averesi ± le eseesega masani (averesi ± SD) o le 5 faʻataʻitaʻiga faʻaola (n = 5). O mataʻitusi eseese e faʻaalia ai eseesega taua faʻamaufaʻailoga i le va o togafitiga (p < 0.05).