O le fa'avasegaina o porotini i le auala fa'alilolilo e taua tele mo le fa'atumauina o le vaevaeina o sela ma le homeostasis. I le fa'aopoopoga i le fa'avasegaina e ala i le atigi, o le matafaioi a lipids i le fa'avasegaina o kinesin i le fa'agasologa o felauaiga fa'alilolilo o se fesili masani ua leva ona iai e le'i taliina. O iinei, matou te fa'atinoina ai le 3D fa'atasi lanu eseese maualuga-resolution real-time imaging e fa'amaonia ai i totonu o le tino o porotini fou ua fa'apipi'iina i le glycosylphosphatidylinositol-immobilized ma vaega uumi o lipid ceramide ua fa'aputuina ma fa'avasegaina i endoplasms fa'apitoa Net exit site, lea e ese mai le mea e fa'aaogaina e porotini transmembrane. I se fa'aopoopoga, matou te fa'aalia ai o le umi o le filifili o le ceramide i le membrane endoplasmic reticulum e taua tele mo lenei filifiliga fa'avasegaina. O la matou su'esu'ega e maua ai le fa'amaoniga muamua tuusa'o i totonu o le tino e fa'avasegaina ai uta o porotini e fa'atatau i le umi o le filifili lipid i nofoaga fa'atau atu filifilia i le auala fa'alilolilo.
I totonu o sela eukaryotic, o porotini na faia i totonu o le endoplasmic reticulum (ER) ona fa'avasega lea i le taimi o felauaiga e ala i le auala faalilolilo mo le tu'uina atu i lo latou taunu'uga talafeagai i le sela (1). I le fa'aopoopoga i le fa'avasega e ala i le ufiufi, sa leva ona manatu o nisi lipids e mafai foi ona avea ma nofoaga e alu ese ai e ala i le fa'aputuina i totonu o vaega fa'apitoa o le membrane e fa'apitoa ai porotini (2-5). Peita'i, e leai lava ni fa'amaoniga tuusa'o i totonu o le tino e fa'amaonia ai lenei faiga e mafai ona fa'avae i luga o le lipid. Ina ia foia lenei fa'afitauli autu, na matou su'esu'eina i le yeast pe fa'apefea ona fa'atau ese'ese porotini fa'amau glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) mai le ER. O GPI-APs o se ituaiga o porotini i luga o le sela e feso'ota'i ma lipid (6, 7). O le GPI-AP o se porotini fa'amau e fa'apipi'i i laupepa pito i fafo o le membrane plasma e ala i le vaega glycolipid (GPI anchor). Latou te taliaina GPI anchors o ni suiga fa'asao pe a uma ona fa'aliliu i le ER lumen (8). A maeʻa ona faʻapipiʻi, e ui atu le GPI-AP i totonu o le Golgi apparatus (5, 9) mai le ER i le plasma membrane. O le iai o taula o le GPI e mafua ai ona feaveaʻi eseese le GPI-AP mai porotini ua faʻasalalauina e le transmembrane (e aofia ai isi porotini o le plasma membrane) i le auala faʻasalalauina (5, 9, 10). I totonu o sela yeast, e vavaeʻeseina GPI-AP mai isi porotini ua faʻasalalauina i totonu o le endoplasmic reticulum, ona afifiina lea i totonu o ni vesicles tulaga ese ua afifiina e le coat protein complex II (COPII) (6, 7). E le o manino mea e mafua ai lenei faiga faʻavasega i le faiga o le auina atu i fafo o le ER, ae o loʻo masalomia o lenei faiga e ono manaʻomia ai lipids, aemaise lava le toe faʻaleleia o le fausaga o le vaega lipid o le taula o le GPI (5, 8). I le yeast, e amata loa le toe faʻaleleia o lipids o le GPI pe a uma ona faʻapipiʻi le GPI, ma i le tele o tulaga, e mafua ai ona fusifusia le ceramide i le 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). O le C26 ceramide o le ceramide autū lea e gaosia e sela o le yeast i le taimi nei. E fa'aputuina i totonu o le ER ma o le tele lava e auina atu i le Golgi apparatus e ala i COPII vesicles (13). O le auina atu i fafo o le ER o le GPI-AP e mana'omia ai le fa'aauauina o le fa'aputuina o le ceramide (14, 15), ma o le liua o le ceramide i le inositol phosphate ceramide (IPC) i le Golgi apparatus e fa'alagolago i le fa'aputuina o le GPI anchor (16). O su'esu'ega fa'aletino ma membrane fa'apitoa ua fa'aalia ai e mafai e ceramides filifili acyl uumi ona fa'atasi e fausia ai ni vaega fa'atulagaina ma ni meatotino fa'aletino tulaga ese (17, 18). O nei fa'amaumauga e tau atu ai i le manatu o le C26 ceramide ma le GPI-AP fa'atasi ai ma le C26 ceramide e fa'aogaina a latou meatotino fa'aletino e fa'atasi ai i ni vaega fa'atulagaina po'o ni vaega i totonu o le siosiomaga lipid membrane ER e matua leaga lava. E tele lava ina aofia ai glycerolipids pupuu ma le le'i fa'atumuina (C16:1 ma le C18:1) (19, 20). O nei vaega o le a taula’i fa’apitoa i nofoaga fa’apitoa e alu ese ai le ER (ERES), lea e mafai ona fa’atasi ai le ceramide ma le GPI-AP e fa’avae i le ceramide i le Golgi i le vesicle COPII lava e tasi (5).
I lenei suʻesuʻega, ua matou faʻataʻitaʻiina saʻo lenei faiga faʻavae-lipid e ala i le faʻaaogaina o le super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), o se metotia faʻaonaponei o le microscopy e mafai ona matauina i le taimi e tasi ia porotini ua faʻailogaina i le fluorescent. O ata e tolu-lanu ma tolu-dimensional (3D) e matua maualuga lava le iugafono ma le saoasaoa i totonu o sela ola (21, 22).
Na matou faʻaaogaina muamua le tekinolosi SCLIM e faʻamatalaina atili ai le auala na suʻesuʻeina ai le GPI-AP masani ma le vaega C26 ceramide mai porotini na faʻasalalauina e le membrane ina ua maeʻa ona tuʻua le ER i le S. cerevisiae. Ina ia siaki le faʻavasegaga o le ER, na matou faʻaaogaina se faiga faʻasolopito e mafai ona vaʻaia saʻo ai uta fou na faʻapipiʻiina o loʻo ulufale i le ERES i totonu o le tino (7, 23). I le avea ai ma uta, na matou filifilia le C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 ua faʻailogaina i le porotini fluorescent lanumeamata (GFP) ma le porotini na faʻasalalauina e le membrane Mid2 ua faʻailogaina i le porotini fluorescent latalata-infrared (iRFP), o ia mea uma e lua e faʻatatau i le membrane plasma (24–26). I le sec31-1 temperature-sensitive mutant, o nei uta e lua e faʻaalia i lalo o se galactose-inducible promoter ma se faʻailoga ERES. I le vevela tele (37°C), ona o le sec31-1 mutation e aʻafia ai le galuega a le vaega o le COPII coat Sec31 e taofia ai le germination o le COPII ma le auina atu o le ER, o uta fou na faʻapipiʻiina e faʻaputuina i le ER (23). A maeʻa ona mālūlū i le vevela maualalo (24°C), na toe maua mai ai sela o le sec31-1 mutant mai le vaega e teu ai sela, ma amata ona auina atu i fafo le uta fou ua faaputuputu mai le ER. Na faaalia i le vaaiga a le CLIM o le tele o Gas1-GFP ma Mid2-iRFP ua faatoa tuufaatasia na faaputuputu pea i le ER o sela o le sec31-1 mutant ina ua maeʻa ona faʻasusu i le 37°C ona toe faʻasaʻoloto lea i le 24°C mo le 5 minute (Ata 1). Talu ai ona o le Mid2-iRFP ua tufatufa atu i luga o le membrane atoa o le ER, ma o le Gas1-GFP ua faaputuputu ma aoina i le vaega e le o toe faaauauina o le membrane o le ER, o lo latou tufatufaina atu e matua ese lava (Ata 1, A i le C ma le Ata Tifaga S1). E le gata i lea, e pei ona faaalia i le Ata 1D, o le faaputuga o le Gas1-GFP e leai se Mid2-iRFP. O nei taunuuga e faaalia ai o le GPI-AP ma porotini transmembrane na vaevaeina i ni vaega eseese o le membrane o le ER i le amataga. O le vaega o le Gas1-GFP e tuaoi ma se ERES faapitoa ua faailogaina i le porotini ufiufi o le mCherry's COPII Sec13 (Ata 1, E ma le F, ma le ata tifaga S1) (23).
O sela sec31-1 e faʻaalia ai ni mea e faʻaosofia e le galactose, o se filifili acyl umi (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, lanumeamata) ma le porotini transmembrane Mid2-iRFP (TMP, lanumoana) ma o lenei faʻailoga ERES Fausiaina Sec13-mCherry (ERES, magenta) na faʻatupuina i le 37°C mo le 30 minute, faʻaliliuina i le 24°C, ma faʻaalia e le SCLIM 5 minute mulimuli ane. (A i le C) o loʻo faʻaalia ai se ata 2D ua tuʻufaʻatasia pe tasi o se vaʻalele (A), o se ata faʻaaliga 2D o le 10 z-sections (B) poʻo se ata 3D o le hemisphere o le sela o uta ma faʻailoga ERES (C). Pa fua 1μm (A ma le B). O le iunite fua o le 0.551μm (C). Na iloa le Gas1-GFP i vaega ER eseese poʻo ni vaega, aʻo iloa le Mid2-iRFP ma tufatufa atu i le membrane ER atoa (C). (D) O le kalafi o loʻo faʻaalia ai le malosi o le fluorescence faʻatatau o le Gas1-GFP ma le Mid2-iRFP i le va o le Gas1-GFP i luga o le laina aū paʻepaʻe (agavale). AU, iunite faʻafuaseʻi. (E ma le F) o loʻo faʻatusalia ai le ata 3D e tuʻufaʻatasia ai oloa ma le faʻailoga ERES. Na iloa vaʻaiga Gas1-GFP e lata ane i le ERES faʻapitoa. O le iunite fua o le 0.551μm. (F) O le aū paʻepaʻe mafiafia e faʻailogaina ai le vaʻaiga Gas1-GFP e fesoʻotaʻi ma le ERES. O paneli ogatotonu ma taumatau o loʻo faʻaalia ai le ata 3D faʻateleina ua tuʻufaʻatasia ma se vaʻaiga faʻataʻamilomilo o le vaʻaiga Gas1-GFP ua filifilia.
O le vāvālalata vavalalata i le va o le vaega o le Gas1-GFP ma se ERES fa'apitoa e fa'ailoa mai ai e mafai e le Gas1-GFP ona ulufale i le ERES filifilia, lea e ese mai le filifiliga e fa'aaogaina e le Mid2-iRFP e tu'ua ai le ER. Ina ia foia lenei avanoa, na matou fuaina le fua faatatau o le ERES mo na'o le tasi pe lua oloa (Ata 2, A i le C). Na matou iloa ai o le tele o ERES (70%) e na'o le tasi le ituaiga o uta. O le ata pito i lalo o le Ata 2C o lo'o fa'aalia ai ni fa'ata'ita'iga masani se lua o le ERES e na'o le Gas1-GFP (Ata 1) pe na'o le Mid2-iRFP (Ata 2). I se fa'atusatusaga, e tusa ma le 20% o le ERES o lo'o i ai uta e lua e fe'avea'i i le eria lava e tasi. Na maua ai o nisi ERES (10%) o lo'o i ai ituaiga uta e lua, ae na vavae'esea i latou i ni eria eseese manino. O le mea lea, o lenei au'ili'iliga fa'amaumauga e fa'aalia ai a mae'a ona auina atu i fafo le ER, o le GPI-AP Gas1-GFP ma le uta transmembrane Mid2-iRFP ua vaevaeina i ni ERES eseese (Ata 2D). O lenei lelei o le fa'avasegaina e matua ogatasi lava ma le su'esu'ega fa'akemikolo muamua (6) ma le fuafuaina o foliga (7). E mafai foi ona tatou matauina le amioga a le uta ua taofia i totonu o le ERES (Ata 2E ma le Ata Tifaga S2). O lo'o fa'aalia i le Ata 2E e na'o se vaega itiiti o le Gas1-GFP (panel 3) po'o le Mid2-iRFP (panel 4) e ulufale i le ERES mai le tasi itu ma ua taofia i se vaega tu'ufua. O lo'o fa'aalia i le Panel 5 o le Ata 2E o lo'o fa'aalia ai o le Gas1-GFP ma le Mid2-iRFP e maua i nisi taimi i le ERES lava e tasi, ae latou te ulufale mai i itu eseese ma ua fa'aputuina i vaega eseese e ono fa'atusalia ai vesicles COPII eseese. Na matou fa'amaonia foi o le vavae'eseina ma le fa'avasegaina o le C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 o se ERES filifilia e fa'apitoa ona o le isi uta fa'asa'oloto transmembrane, o le porotini membrane plasma ua fa'ailogaina e le GFP Axl2 (27), o lo'o fa'aalia ai amioga tutusa ma le Mid2-iRFP. (Ata S1 ma le Ata Tifaga S3). O le Axl2-GFP fou ua fa'aputuina ua tufatufa atu i le membrane ER e pei o le Mid2-iRFP (Ata S1, A ma le B), ma ua fa'apipi'i fa'atasi ma le Mid2-iRFP i le tele o ERES (Ata S1, B i le D). Panels 1 ma le 2 o le Ata 1. S1C o lo'o fa'aalia ai ni fa'ata'ita'iga masani se lua o le ERES lea e fe'avea'i ai uta e lua o le transmembrane. I nei tulaga, e ulufale fa'atasi uma oloa e lua i le ERES (Ata S1E, Panel 3 ma le Movie S3).
O sela sec31-1 o loʻo faʻaalia ai ni galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, lanumeamata) ma le Mid2-iRFP (TMP, lanumoana) ma le faʻailogaina o le ERES o le Sec13-mCherry (ERES, magenta) na tuʻuina i le 37. A maeʻa ona faʻasusu mo le 30 minute i le °C, faʻaseʻe i le 24 °C e faʻasaʻoloto ai le poloka o le secretion, ma faʻaaoga le SCLIM pe a uma le 20 minute. (A i le C) Ata faʻatusa o le 2D projection (A; scale bar, 1μm) poʻo ata 3D o le hemisphere o le sela (B ma le C; scale unit, 0.456μm) o le uta ma vaega z e 10 ua faʻailogaina e le ERES. O le paneli pito i lalo i le (B) ma le paneli i le (C) o loʻo faʻaalia ai ata ua uma ona faʻagasolo e faʻaalia ai naʻo oloa o loʻo i totonu o le ERES (magenta) [Gas1-GFP (efuefu) ma le Mid2-iRFP (lanumoana vaivai)]. (C) Aū tatala: E naʻo le tasi le fasi uta e feaveaʻi e le ERES (1 i le 4). Aū efuefu: O lo'o iai uta tu'ueseese i le ERES (5). Aū pa'epa'e mafiafia: O lo'o iai uta tu'ufaatasi i le ERES. Lalo: O le ERES e tasi ua filifilia e na'o le Gas1-GFP (1) po'o le Mid2-iRFP (2). Pa fua, 100 nm. (D) Fuainumera o le ata maikolokalama o lo'o fa'amatalaina i le (C). O le pasene averesi o le ERES e na'o le tasi le uta (Gas1-GFP po'o le Mid2-iRFP), uta tu'ueseese ma uta fe'avea'i. I fa'ata'ita'iga tuto'atasi e tolu, n=432 i le 54 sela. Pa sese = SD. Su'ega t e le'i fa'apa'iaina e lua-si'usi'u. *** P = 0.0002. (E) Ata 3D o le ERES ua filifilia o uta ua taofia ua fa'ailogaina i le (C). Gas1-GFP (lanumeamata) (3) po'o le Mid2-iRFP (lanumoana) (4) ua ulufale i le ERES (magenta) mai le tasi itu ma ua fa'atapula'aina i se vaega la'ititi i totonu o le ERES. O nisi taimi, e ulufale uma ituaiga uta e lua i le ERES tutusa (5) mai le itu e tasi ma fa'atapula'aina i se nofoaga tu'ufua i totonu o le ERES. Pa fua, 100 nm.
Sosoo ai, na matou tofotofoina se manatu e faapea o le ceramide long acyl chain (C26) o loʻo i totonu o le membrane ER e faʻatautaia ai le faʻaputuga ma le faʻavasegaina faʻapitoa o Gas1 i totonu o le ERES filifilia. Mo lenei faʻamoemoe, na matou faʻaaogaina ai se ituaiga yeast ua suia GhLag1, lea na suia ai le lua endogenous ceramide synthases Lag1 ma Lac1 e GhLag1 (le Lag1 homolog o le cotton), ma iʻu ai i se ituaiga yeast ma se membrane cell Ceramide strain e puʻupuʻu atu nai lo le wild type (Ata 3A) (28). O le suʻesuʻega o le mass spectrometry (MS) na faʻaalia ai i ituaiga wild-type, 95% o le aofaʻi o ceramide o le chain ceramide e matua umi lava (C26), ae i le GhLag1, 85% o le ceramide e matua umi lava (C18 ma le C16). ), naʻo le 2% o le ceramide o le chain ceramide e matua umi lava (C26). E ui o le C18 ma le C16 ceramides o ceramides autū ia na iloa i le membrane GhLag1 i le taimi nei, ae na faʻamaonia foʻi e le suʻesuʻega a le MS o le taula GPI o le Gas1-GFP o loʻo faʻaalia i le ituaiga GhLag1 o loʻo i ai le C26 ceramide, lea e tutusa ma lipids wild-type. E tutusa lava le lelei (Ata 3A) (26). O le mea lea, o lona uiga o le enzyme remodeling ceramide Cwh43 e matua filifilia lava mo le C26 ceramide, e pei ona faʻaalia i le Ata 26, e sili atu ona faʻapipiʻiina le taula GPI mai se vaega itiiti o le C26 ceramide i le ituaiga GhLag1. S2 (29). Ae ui i lea, o le membrane cell o le GhLag1 e naʻo le C18-C16 ceramide e aofia ai, ae o loʻo i ai pea le C26 ceramide i le Gas1-GFP. O lenei mea moni e avea ai lenei ituaiga ma meafaigaluega lelei e foia ai le faʻafitauli o le umi o le acyl chain o le membrane ceramide i le ER. O le matafaioi faʻapitoa o le vasega ma le faʻavasegaina. Ona matou suʻesuʻeina muamua lea o le gafatia o le C26 Gas1-GFP e faʻaputu i totonu o ni vaega i le GhLag1 faʻatasi ai ma se allele mutant e maaleale i le vevela o le sec31-1 e ala i le microscopy fluorescence masani, lea e naʻo le filifili umi (C18-C16) o loʻo i ai i le membrane ER Ceramide (Ata 3). Na matou matauina i le sec31-1, o le tele o Gas1-GFP sa faʻaputuina i totonu o ni vaega, ae o Gas1-GFP i le sec31-1 GhLag1 faʻatasi ai ma le membrane ceramide ER umi (C18-C16) e leʻi faʻaputuina ma tufatufaina i totonu o le membrane ER atoa. Ina ia saʻo, ona o le faʻaputuina o le C26 ceramide e fesoʻotaʻi vavalalata ma ERES faʻapitoa (Ata 1), na matou suʻesuʻeina ai pe o lenei faiga e ono aofia ai foʻi le galuega a le faiga o le porotini auina atu i fafo o le ER. E faʻaaogaina e le GPI-AP se faiga faʻapitoa COPII mo le auina atu i fafo o le ER, lea e faʻatonutonuina malosi e le toe faʻaleleia o le fausaga a Ted1 o le vaega glycan o le taula GPI (30, 31). Ona iloa lea o le GPI-glycan recombinant e le transmembrane cargo receptor p24 complex, lea e toe fa'afaigaluegaina ai le Lst1, o se isoform fa'apitoa o le vaega autu o le COPII cargo binding subunit Sec24, ma fausia ai se GPI-AP-rich COPII Vesicles e mana'omia (31-33). O le mea lea, na matou fausia ai se mutant fa'alua lea na tu'ufa'atasia ai le tapeina o nei porotini ta'itasi (le vaega o le p24 complex Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 ma le vaega fa'apitoa o le COPII Lst1) fa'atasi ai ma le sec31-1 mutant strain, ma su'esu'eina i latou Pe mafai ona fausia le Gas1-cluster GFP (Ata 3). Na matou matauina i le sec31-1emp24Δ ma le sec31-1ted1Δ, o le Gas1-GFP e tele lava ina le fa'aputuina ma tufatufaina i totonu o le membrane ER, e pei ona va'aia muamua i le sec31-1 GhLag1, ae i le sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP E pei o le sec31-1. O nei taunuuga e faʻaalia ai e faʻaopoopo atu i le i ai o le C26 ceramide i le membrane ER, o le faʻaputuga o le Gas1-GFP e manaʻomia foʻi ona fusifusia i le p24 complex, ma e le manaʻomia ai se faʻafaigaluegaina faapitoa o le Lst1. Ona matou suʻesuʻeina lea o le avanoa e mafai ai e le umi o le filifili o le ceramide i le membrane ER ona faʻatonutonuina le fusifusia o le Gas1-GFP i le p24. Peitaʻi, na matou iloa ai o le i ai o le C18-C16 ceramide i le membrane e le afaina ai le GPI-glycans na toe fausia e le p24 complex (Ata S3 ma le S4, A ma le B) poʻo le fusifusia i le GPI-AP ma le auina atu o le GPI-AP. gafatia. Faʻafaigaluega le COPII subtype Lst1 (Ata S4C). O le mea lea, o le faʻaputuga e faʻalagolago i le ceramide C26 e le manaʻomia ai fegalegaleaiga o porotini ma auala eseese o porotini e auina atu ai le ER, ae lagolagoina se auala faʻavasega ese e faʻatautaia e le umi o lipid. Ona matou suʻesuʻeina lea pe taua le umi o le filifili o le ceramide acyl i le membrane ER mo le faʻavasegaina lelei o le Gas1-GFP o se ERES filifilia. Talu ai ona o le Gas1 i le ituaiga GhLag1 faatasi ai ma le ceramide filifili pupuu e tuua le ER ma ulufale atu i le membrane plasma (Ata S5), matou te talitonu afai o le faavasegaina e faʻatinoina e le umi o le filifili ceramide acyl, o le Gas1 i le ituaiga GhLag1 e mafai ona toe faʻafeiloaʻi ma sopoia. O oloa ERES ma le membrane lava e tasi.
(A) O le membrane o le sela o le GhLag1 e tele lava ina aofia ai ni ceramides pupuu C18-C16, ae o le taula GPI o le Gas1-GFP o loʻo i ai pea le C26 IPC tutusa e pei o sela wild-type. I luga: auiliiliga o le umi o le acyl chain o le ceramide i le membrane o le sela wild-type (Wt) ma le GhLag1p strains e ala i le mass spectrometry (MS). O faʻamaumauga o loʻo faʻatusalia ai le pasene o le aofaʻi o le ceramide. O le averesi o faʻataʻitaʻiga tutoʻatasi e tolu. Error bar = SD. T-test e lua-tailed unpaired. **** P ＜0.0001. Panel pito i lalo: Suʻesuʻega MS o le umi o le acyl chain o le IPC o loʻo i totonu o le Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI anchor o loʻo faʻaalia i le wild-type ma le GhLag1p strains. O faʻamaumauga o loʻo faʻatusalia ai le pasene o le aofaʻi o le faʻailoga IPC. Averesi o faʻataʻitaʻiga tutoʻatasi e lima. Error bar = SD. T-test e lua-tailed unpaired. ns, e le taua. P = 0.9134. (B) O ata maikolo o le fluorescence o sela o le sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ma le sec31-1lst1Δ o loʻo faʻaalia ai le Gas1-GFP na faʻaosofia e le galactose na faʻatupuina i le 37°C mo le 30 minute ma tuʻuina atu i lalo e Faia le microscopy fluorescence masani pe a uma le 24°C. Aū paʻepaʻe: ER Gas1-GFP cluster. Aū tatala: O le Gas1-GFP e leʻi faʻaputuina ua salalau i luga o le membrane ER atoa, o loʻo faʻaalia ai le valiina o le mama faʻaniukilia o le ER. Pa fua, 5μm. (C) Fuainumera o le photomicrograph o loʻo faʻamatalaina i le (B). O le pasene averesi o sela ma le fausaga o le Gas1-GFP punctate. I faʻataʻitaʻiga tutoʻatasi e tolu, n≥300 sela. Pa sese = SD. Suʻega t e lua-tailed e leʻi faʻapaʻiaina. **** P ＜0.0001.
Ina ia foia sa'o lenei fa'afitauli, na matou fa'atinoina le SCLIM visualization o le Gas1-GFP ma le Mid2-iRFP i le GhLag1 fa'atasi ai ma le sec31-1 temperature-sensitive mutant allele (Ata 4 ma le Movie S4). Ina ua mae'a ona taofia le ER i le 37°C ma mulimuli ane fa'asa'olotoina i le 24°C, o le tele o le Gas1-GFP fou na fa'aputuina e le'i fa'aputuina ma tufatufa atu i totonu o le membrane ER, e pei ona matauina e microscopes masani (Ata 4, A ma le B). E le gata i lea, o le pasene tele o le ERES (67%) e aofia ai ituaiga e lua o uta o lo'o i totonu (Ata 4D). O Panels 1 ma le 2 o le Ata 4C o lo'o fa'aalia ai ni fa'ata'ita'iga masani se lua o le ERES ma le Gas1-GFP ma le Mid2-GFP e fe'avea'i. E le gata i lea, o oloa uma e lua na fa'afaigaluegaina i totonu o le ERES lava e tasi (Ata 4E, panel 3 ma le movie S4). O le mea lea, o a matou taunu'uga e fa'aalia ai o le umi o le ceramide acyl chain i le membrane ER o se mea taua e fuafua ai le fa'aputuga ma le fa'avasegaina o polotini ER.
Sela Sec31-1 GhLag1 o loʻo faʻaalia ai ni mea e faʻaosofia e le galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, lanumeamata) ma le Mid2-iRFP (TMP, lanumoana) ma le ERES-faʻailogaina Sec13-mCherry (ERES, magenta) Faʻasusu i le 37°C. Faʻaauau mo le 30 minute, faʻapaʻu i le 24°C e faʻasaʻoloto ai mea e faʻaosofia, ma faʻaaoga le SCLIM pe a uma le 20 minute. (A i le C) Ata faʻatusa o le 2D projection (A; scale bar, 1μm) poʻo ata 3D o le hemisphere o le sela (B ma le C; scale unit, 0.45μm) o vaega z e 10 ua faʻailogaina i uta ma le ERES. O le paneli pito i lalo i le (B) ma le paneli i le (C) o loʻo faʻaalia ai ata ua faʻagasoloina e faʻaalia ai naʻo oloa o loʻo iai i le ERES (magenta) [Gas1-GFP (efuefu) ma le Mid2-iRFP (lanumoana vaivai)]. (C) Aū paʻepaʻe ua tumu: ERES, oloa e feʻaveaʻi. Aū tatala: E na'o le tasi le mea o lo'o i totonu o le ERES. Panel pito i lalo: O le ERES ua filifilia o lo'o i ai oloa fe'avea'i (1 ma le 2) ua fa'ailogaina i le (C). Pa fua, 100 nm. (D) Fuainumera o le photomicrograph o lo'o fa'amatalaina i le (C). I totonu o le sec31-1 ma le sec31-1 GhLag1 iunite, e na'o le tasi le uta (Gas1-GFP po'o le Mid2-iRFP) o lo'o aofia ai, ma le pasene averesi o le ERES mo uta tu'ufua ma uta fe'avea'i. I fa'ata'ita'iga tuto'atasi e tolu, n = 432 i le 54 sela (sec31-1) ma le n = 430 i le 47 sela (sec31-1 GhLag1). Pa sese = SD. Su'ega t e lua-tailed e le'i fa'apa'iaina. *** P = 0.0002 (sec31-1) ma le ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Ata 3D o le ERES ua filifilia ma uta fe'avea'i (3) ua fa'ailogaina i le (C). E fa'alatalata atu le Gas1-GFP (lanumeamata) ma le Mid2-iRFP (lanumoana) i le ERES (lanu samasama) mai le itu e tasi ma tumau ai i le vaega lava e tasi e fa'atapula'aina e le ERES. Pa fua, 100 nm.
O lenei suʻesuʻega e tuʻuina atu ai faʻamaoniga tuusaʻo i totonu o le tino ola (in vivo) o uta o porotini e faʻavae i luga o lipid ua vaevaeina i ni nofoaga filifilia e auina atu i fafo i le auala faalilolilo, ma faʻaalia ai le taua o le umi o le filifili acyl mo le filifilia o le faʻavasegaina. I le faʻaaogaina o se metotia microscopy malosi ma faʻaonaponei e taʻua o le SCLIM, na matou faʻaalia ai le Gas1-GFP fou ua faʻapipiʻiina (o se membrane plasma tele GPI-AP ma se vaega lipid acyl chain (C26) ceramide umi tele) i le fefete) O vaega o loʻo faʻaputuina i ER eseese e fesoʻotaʻi ma ERES faʻapitoa, aʻo porotini e faʻasaʻolotoina e le transmembrane e tufatufa atu i le membrane ER atoa (Ata 1). E le gata i lea, o nei ituaiga oloa e lua e ulufale atu i ERES eseese ma le filifilia (Ata 2). O le umi o le filifili acyl o le ceramide sela i totonu o le membrane e faʻaitiitia mai le C26 i le C18-C16, o le vaega o le Gas1-GFP e faʻalavelaveina i totonu o le vaega ER eseese, ma o le Gas1-GFP e toe faʻafoʻi e tuʻua le ER faʻatasi ai ma le porotini transmembrane e ala i le ERES lava e tasi (Ata 3 ma le Ata 3). 4).
E ui lava ina fa'aaogaina e le GPI-AP se faiga fa'apitoa o porotini e alu ese ai mai le ER, ae na matou iloa ai o le vavae'eseina o le C26 ceramide-dependent e le fa'alagolago i fegalegaleaiga eseese o porotini e ono o'o atu ai i le fa'apitoa o le ERES (Ata S4 ma le S5). Nai lo lena, o a matou sailiga e lagolagoina ai se isi faiga fa'avasegaga e fa'atinoina e le fa'aputuga o porotini e fa'avae i luga o lipid ma le mulimuli ane fa'ate'aina o isi uta. O a matou matauga e fa'aalia ai o le itulagi po'o le fa'aputuga o le Gas1-GFP e feso'ota'i ma se ERES fa'apitoa e leai se porotini fa'alilolilo transmembrane Mid2-iRFP, lea e fa'ailoa mai ai o le fa'aputuga GPI-AP fa'alagolago i le C26 ceramide o le a fa'afaigofieina ai lo latou ulufale atu i le ERES talafeagai, ma i le taimi lava e tasi, e le aofia ai le transmembrane. O mea e fa'alilolilo e ulufale atu i lenei ERES fa'apitoa (Ata 1 ma le 2). I se fa'atusatusaga, o le i ai o le C18-C16 ceramides i le membrane ER e le mafua ai ona fausia e le GPI-AP ni itulagi po'o ni fa'aputuga, o lea latou te le fa'ate'aina pe suia ai porotini fa'alilolilo transmembrane i totonu o le ERES lava e tasi (Ata 3 ma le 4). . O le mea lea, matou te fautuaina ai o le C26 ceramide e faʻaleleia ai le vavaeʻeseina ma le faʻavasegaina e ala i le faʻafaigofieina o le faʻaputuina o porotini e fesoʻotaʻi ma ERES faʻapitoa.
E faʻapefea ona ausia lenei faʻaputuga faʻalagolago i le C26 ceramide i totonu o se vaega faʻapitoa o le ER? O le uiga masani o le membrane ceramide e vavae ese i autafa e ono mafua ai ona fausia e le GPI-AP ma le C26 ceramide ni lipids laiti ma vave ona faʻatulagaina i totonu o le siosiomaga lipid e le masani ai o le membrane ER o loʻo i ai glycerolipids pupuu ma le le faʻatumuina. Faʻaputuga lelei (17, 18). O nei faʻaputuga laiti le tumau e mafai ona faʻapipiʻi atili i ni faʻaputuga tetele ma sili atu ona mautu pe a uma ona fusifusia i le p24 complex (34). E ogatasi ma lenei mea, na matou faʻaalia ai e manaʻomia e le C26 Gas1-GFP ona fegalegaleai ma le p24 complex e fausia ai ni faʻaputuga tetele e vaʻaia (Ata 3). O le p24 complex o se heterozygous oligomer e aofia ai ni porotini p24 transmembrane eseese e fa i le yeast (35), lea e maua ai le fusifusia tele, lea e mafai ona oʻo atu ai i le fesoʻotaʻiga o faʻaputuga laiti o le GPI-AP, ma faʻatupuina ai le faʻaputuga Stable tele (34). O le fegalegaleaiga i le va o le ectodomains o le porotini o le GPI-APs e mafai foi ona fesoasoani i lo latou faʻaputuga, e pei ona faʻaalia i le taimi o la latou felauaiga Golgi i totonu o sela epithelial polarized mammalian (36). Peitaʻi, pe a iai le C18-C16 ceramide i le membrane ER, pe a fusifusia le p24 complex i le Gas1-GFP, o le a le faia ni vaega tetele eseese. O le faiga autu e ono faʻalagolago i meatotino faʻapitoa faaletino ma vailaʻau o le ceramide long acyl chain. O suʻesuʻega faʻapitoa o membrane faʻapitoa e faʻaalia ai e ui lava o ceramides long (C24) ma le short (C18-C16) acyl chain e mafai ona mafua ai le vavaeʻeseina o le vaega, naʻo ceramides long acyl chain (C24) e mafai ona faʻalauiloa le Curvature maualuga ma le film bending e toe faʻatulaga ai le ata. E ala i le faʻasinomaga tutusa (17, 37, 38). Ua faʻaalia o le transmembrane helix o le TMED2, o le homologue o le tagata o le Emp24, e fegalegaleai ma le sphingomyelin e faʻavae i luga o le ceramide C18 i totonu o lobules cytoplasmic (39). I le faʻaaogaina o faʻataʻitaʻiga o le molecular dynamics (MD), na matou iloa ai o loʻo faʻaputuina uma le C18 ma le C26 ceramides i tafatafa o le cytoplasmic lobules o le Emp24 transmembrane helix, ma e tutusa o latou manaʻoga (Ata S6). E taua le maitauina o lenei mea e faʻaalia ai o le transmembrane helix o le Emp24 e mafai ona oʻo atu ai i le tufatufaina tutusa o lipids i totonu o le membrane. O se taunuuga talu ai nei lea e faʻavae i luga o sela mammalian. O faʻataʻitaʻiga MD tutusa e faʻaalia ai foʻi le i ai o ether lipids (40). O le mea lea, matou te mateina o le C26 ceramide i totonu o lobules e lua o le ER26 e faʻamauoa i le lotoifale. A pipii saʻo le GPI-AP i totonu o le luminal lobules i le multivalent p24 ma le faʻaputuina o le C26 ceramide i tafatafa o le p24 i totonu o le cytoplasmic lobules, e mafai ona faʻalauiloa ai le faʻaputuga o le Protein ma le curvature o le membrane e mafua mai i tamatamailima (41), ma mafua ai ona vavaeʻese le GPI-AP i ni vaega eseese e lata ane i le ERES, lea e fiafia ai foʻi i vaega piʻo maualuga o le membrane ER (42). O lipoti na muamua atu na lagolagoina le faiga na fautuaina (43, 44). O le fusifusia tele o oligolectins, pathogens poʻo antibodies i glycosphingolipids (GSL) e faʻavae i luga o le ceramide i luga o le membrane plasma e faʻaosofia ai le tele o le GSL aggregation, faʻaleleia atili ai le vaevaega o le vaega ma mafua ai le faʻaleagaina o le membrane ma le internalization (44). Iwabuchi ma isi. (43) Na maua ai o le i ai o ni filifili acyl uumi (C24) ae le o ni filifili acyl pupuu (C16), o le ligand televalent e fusifusia i le GSL lactosylceramide na mafua ai le fausiaina o ni faaputuga tetele ma le membrane invagination, ma o le cytoplasm Lyn-mediated signal transduction i luga o le cytoplasm e fesoʻotaʻi ma filifili acyl i neutrophils ua fesoʻotaʻi.
I totonu o sela epithelial polarized o mammalian, o le faʻaputuga o le anti-Golgi network (TGN) i le tulaga o le apical plasma membrane e pulea ai le vavaeʻeseina ma le faʻavasegaina o le GPI-AP (10, 45). O lenei faʻaputuga e faʻamalosia e le GPI-AP oligomerization (36), ae e mafai foi ona faʻalagolago i le umi o le filifili ceramide tatou te maua i le yeast. E ui o le mammalian GPI-AP e iai se taula e faʻavae i luga o le lipid ether, ma o lona fausaga faʻakemikolo e matua ese lava mai le acyl chain ceramide umi tele, o se suʻesuʻega talu ai nei na maua ai o lipids uma e lua e tutusa le evolusione o meatotino faʻaletino ma faʻakemikolo ma galuega (40). O le mea lea, o le vaega ether lipid i sela mammalian atonu e tutusa ma le C26 ceramide i le yeast, ma o lana matafaioi o le faʻafesoʻotaʻi ma le long-chain ceramide i le membrane e faʻalauiloa ai le faʻaputuga ma le faʻavasegaina o le GPI-AP. E ui lava o lenei avanoa e manaʻomia pea ona faʻataʻitaʻiina saʻo, o suʻesuʻega muamua e lagolagoina ai o le felauaiga o le long acyl chain ceramide i le Golgi body e le o faia e cytoplasmic transfer proteins, ae faʻalagolago i le synthesis o GPI anchors e pei o le yeast. O le mea lea, o le faiga fa'asao o le evolusione e foliga mai e mafai ona fa'atasia fa'atasi le ceramide acyl chain umi ma le GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) i totonu o le vesicle felauaiga lava e tasi.
I totonu o le yeast ma mammalian polarized epithelial cell systems, o le GPI-AP aggregation ma le vavaeʻeseina mai isi plasma membrane proteins e tutupu uma aʻo leʻi oʻo atu i le cell surface. Na maua e Paladino et al. (48) i luga o le TGN o mammalian polarized epithelial cells, o le GPI-AP clustering e le gata ina manaʻomia mo le faʻavasegaina filifilia o GPI-APs i le apical plasma membrane, ae faʻatonutonuina foʻi le faʻatulagaina o le clustering o GPI-APs ma lana gaioiga faʻaola. Cell surface. I le yeast, o lenei suʻesuʻega na faʻaalia ai o le C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster i luga o le ER e mafai ona faʻatonutonuina le faʻatulagaina o le cluster ma le gaioiga faʻatino a le GPI-AP i luga o le plasma membrane (24, 49). E ogatasi ma lenei faʻataʻitaʻiga, o sela GhLag1 e maʻi i GPI inhibitors poʻo vailaʻau e aʻafia ai le atoatoa o le puipui o le sela (28), ma le manaʻomia o le functional Gas1-GFP clusters (49) o le tip ceramide o loʻo faʻaalia i le faʻatasiga o sela yeast e faʻaalia ai G​​​ Aʻafiaga faʻaletino o sela hLag1. GPI-AP error. Peita'i, o le fa'aauauina o su'esu'ega pe ua fa'apolokalameina le fa'atulagaga fa'atino o le fogā'ele'ele o le sela mai le ER e ala i se metotia fa'avasega e fa'avae i luga o le umi o lipid o le a avea ma autu o a matou su'esu'ega i le lumana'i.
O ituaiga Saccharomyces cerevisiae na fa'aaogaina i lenei galuega o lo'o lisiina i le Laulau S1. O ituaiga MMY1583 ma MMY1635 o le SCLIM mo le fa'ata'ita'iga o sela ola na fausia i tua o le W303. O nei ituaiga o lo'o fa'aalia ai le Sec13-mCherry fa'atasi ai ma se pine porotini fluorescent na fausia e fa'aaoga ai le metotia fa'avae i luga o le polymerase chain reaction (PCR) fa'atasi ai ma le pFA6a plasmid o se fa'ata'ita'iga (23). O le ituaiga o lo'o fa'aalia ai le Mid2-iRFP ua fa'ailogaina i le porotini fluorescent i lalo o le pulea e le promoter GAL1 na fausia e pei ona taua i lalo. PCR fa'ateleina o le fa'asologa o le iRFP-KanMx mai le vector pKTiRFP-KAN (meaalofa a E. O'Shea, Addgene plasmid number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; fa'ailoga punaoa su'esu'e (RRID): Addgene_64687) Ma fa'aofi i totonu o le C-terminus o le endogenous Mid2. Ina ua maeʻa ona faʻateleina le faʻasologa o le genome Mid2-iRFP ma faʻapipiʻiina i totonu o le GAL1 promoter, ona tuʻufaʻatasia lea i totonu o le Not I-Sac I site o le integration plasmid pRS306. O le plasmid na maua mai ai le pRGS7 na faʻatulagaina faʻatasi ma le Pst I e tuʻufaʻatasia ai i totonu o le URA3 locus.
O le Gas1-GFP fusion gene o loʻo faʻaalia i lalo o le pule a le GAL1 promoter i le centromere (CEN) plasmid, lea ua fausia e pei ona taua i lalo. O le Gas1-GFP sequence na faʻateleina e le PCR mai le pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (meaalofa a L. Popolo) ma faʻapipiʻiina i totonu o le Xma I–Xho I site o le CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (meaalofa a C). Miller; Addgene plasmid number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). O le plasmid na maua na faaigoaina o le pRGS6. O le Axl2-GFP fusion gene o loʻo faʻaalia foʻi i lalo o le pule a le GAL1 promoter o le pBEVY-GL LEU2 vector, ma o lona fausiaina e pei ona taua i lalo. O le fa'asologa o le Axl2-GFP na fa'ateleina mai le plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) e ala i le PCR, ma fa'apipi'iina i totonu o le nofoaga o le Bam HI-Pst I o le vector pBEVY-GL LEU2. O le plasmid na maua mai ai na faaigoaina o le pRGS12. O le fa'asologa o oligonucleotides na fa'aaogaina i lenei su'esu'ega o lo'o lisiina i le Laulau S2.
O le ituaiga sa faaopoopoina i le 0.2% adenine ma le 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] rich yeast extract protein p (YP) medium (1% Yeast extract ma le 2% protein ept). (YPR)] po o le 2% galactose [YP-galactose (YPG)] e fai ma puna o le kaponi, po o se synthetic minimal medium (0.15% yeast nitrogen base ma le 0.5% ammonium sulfate) e faaopoopo i amino acids ma bases talafeagai e manaomia mo mea'ai, ma o loo i ai le 2% glucose (synthetic glucose minimal medium) po o le 2% galactose (synthetic galactose minimal medium) e fai ma puna o le kaponi.
Mo le faia o ata i le taimi moni, o sela mutant sec31-1 e maaleale i le vevela o loʻo faʻaalia le fausaga i lalo o le GAL1 promoter na totoina i le YPR medium i le 24°C i le po atoa seia oo i le ogatotonu o le log phase. Ina ua maeʻa ona faʻaosoina i le YPG i le 24°C mo le 1 itula, ona faʻatupuina lea o sela i le SG i le 37°C mo le 30 minute, ona faʻaliliuina lea i le 24°C e faʻasaʻoloto mai le poloka faʻasaʻoloto. Na faʻaaogaina le Concanavalin A e faʻamau ai sela i luga o se slide tioata ma puʻeina ata e le SCLIM. O le SCLIM o se tu'ufa'atasiga o le Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope ma le UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus), le saoasaoa maualuga ma le fua fa'atatau maualuga o le signal-to-noise rotating disc confocal scanner (Yokogawa Electric), spectrometer fa'apitoa, ma le fa'amālūlūina fa'apitoa. O le fa'amalosia o le ata o le system (Hamamatsu Photonics) e mafai ona maua ai se faiga fa'ateleina o le tioata ma se fa'ateleina mulimuli o le ×266.7 ma se meapueata masini e fa'apipi'i ai le totogi e fa'ateleina ai eletise (Hamamatsu Photonics) (21). O le mauaina o ata e faia e ala i polokalama fa'apitoa (Yokogawa Electric). Mo ata 3D, matou te fa'aogaina se piezoelectric actuator fa'apitoa e fa'agae'etia ai le tioata fa'amoemoe i luga, ma aoina vaega opitika e 100 nm le va i totonu o se fa'aputuga. O le ata Z-stack e liua i fa'amaumauga 3D voxel, ma o le galuega fa'avae o le point spread e fa'aaogaina mo le microscope fa'atulagaina o le tisiketi e fa'aaogaina mo le fa'agasologa o le deconvolution e ala i le polokalama Volocity (PerkinElmer). I le fa'aaogaina o le polokalama Volocity e otometi lava ona fa'atapula'aina ai le au'ili'iliga o le nofoaga fa'atasi, na fuaina ai le ERES e aofia ai ma uta. Na faia le au'ili'iliga o le su'esu'ega laina e fa'aaoga ai le polokalama MetaMorph (Molecular Devices).
Faaaoga le polokalama GraphPad Prism e fuafua ai le taua fa'amaumauga. Mo le suega t-t a le Student e lua-tailed ma le suega masani o le au'ili'iliga o le eseesega (ANOVA), o eseesega i le va o vaega e manatu e iai sona aafiaga taua i le P <0.05 (*).
Mo le fluorescence microscopy o le Gas1-GFP, na totoina ai sela o le log phase i le po i le YPD ma aoina e ala i le centrifugation, fufulu faalua i le phosphate buffered saline, ma fa'apuna i luga o le aisa mo le itiiti ifo i le 15 minute, ona fa'aauau lea i lalo o le microscope e pei ona fa'amatalaina muamua Siaki (24). O le Leica DMi8 microscope (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ua fa'apipi'iina i se objective lens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu camera ma le Application Suite X (LAS X) software na fa'aaogaina mo le mauaina.
Sa fa'amamāina fa'ata'ita'iga i le SDS sample buffer i le 65°C mo le 10 minute, ona vaevaeina lea e le SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Mo le su'esu'ega o le immunoblotting, e 10 μl o le fa'ata'ita'iga na fa'atumuina i laina ta'itasi. Antibody autu: Fa'aaoga le rabbit polyclonal anti-Gas1 i le fa'asusuina o le 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 i le fa'asusuina o le 1:500, ma le rabbit polyclonal anti-GFP (o se meaalofa mai ia H. Riezman) i le fa'asusuina o le 1:3000. O le antibody o le isumu monoclonal anti-Pgk1 sa fa'aaogaina i le fa'asusuina o le 1:5000 (o se meaalofa mai ia J. de la Cruz). Antibody lona lua: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) sa fa'aaogaina i le fa'asusuina o le 1:3000 (Pierce). Sa fa'aaogaina le HRP-conjugated goat anti-mouse IgG i le fa'aitiitia o le 1:3000 (Pierce). Sa matauina le vaega o le puipuiga o le tino e ala i le metotia chemiluminescence o le SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
E pei ona faamatalaina i le (31), o se faataitaiga faalenatura o le immunoprecipitation na faia i luga o le vaega ER ua faamauoa. I se aotelega, fufulu sela o le yeast i le TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ma le protease inhibitor mixture) i le 600 nm (OD600) i le 100 optical density faalua. Sa gauia i ni tioata, ona aveese lea o otaota o le sela ma tioata e ala i le centrifugation. Ona centrifuged lea o le supernatant i le 17,000 g mo le 15 minute i le 4°C. Sa toe fa'asusu le pellet i le TNE ma fa'aopoopo le digitalis saponin i se tulaga fa'ai'u o le 1%. Sa fa'asusu le fa'asusu mo le 1 itula ma le fa'ata'amilomilo i le 4°C, ona aveese lea o vaega e le mafai ona soloia e ala i le centrifugation i le 13,000 g i le 4°C mo le 60 minute. Mo le Gas1-GFP immunoprecipitation, fa'asusu muamua le fa'ata'ita'iga i agarose beads gaogao (ChromoTek) i le 4°C mo le 1 itula, ona fa'asusu lea i le GFP-Trap_A (ChromoTek) i le 4°C mo le 3 itula. O beads immunoprecipitated na fufuluina fa'alima i le TNE o lo'o i ai le 0.2% digoxigenin, fa'asusu i le SDS sample buffer, vavae'ese i luga o le SDS-PAGE, ma au'ili'iliina e ala i le immunoblotting.
E pei ona faʻamatalaina i le (31), na faia le fuafuaina o le cross-linking i luga o le vaega ER ua faʻamauoa. I se faapuupuuga, na faʻafefiloi le vaega ER ua faʻamauoa i le 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ISA; 20°C, 20 min). Na faʻaitiitia le tali atu o le crosslinking e ala i le faʻaopoopoina o le glycine (50 mM le faʻamamafa mulimuli, 5 minute, 20°C).
E pei ona faʻamatalaina muamua (50), na faia le suʻesuʻega MS o le ceramide i le wild-type ma le GhLag1 strains. I se aotelega, na faʻatupulaʻia sela i le exponential phase (3 i le 4 OD600 units/ml) i le YPD i le 30°C, ma 25 × 107 sela na seleseleina. O lo latou metabolism e tineia i le trichloroacetic acid. Faaaoga le extraction solvent [ethanol, vai, ether, pyridine ma le 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] ma le 1.2 nmol o le internal standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) quality). Faaaoga le monomethylamine reagent [methanol, vai, n-butanol ma le methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] e faatino ai le mild alkaline hydrolysis o le extract, ona faaaoga lea o le water-saturated n-butanol e aveese ai le masima. I le iuga, na toe fa'asusuina le mea na maua i totonu o se solvent positive mode [chloroform/methanol/vai (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] ma tuiina i totonu o le mass spectrometer. Na faia le multi-reaction monitoring (MRM) mo le fa'ailoaina ma le fuaina o mole mole sphingolipid. O le TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ua fa'apipi'iina i se robotic nanoflow ion source Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) mo le au'ili'iliga o lipid. O le collision energy ua fa'aleleia mo vaega ta'itasi o ceramide. Na maua fa'amatalaga MS i le positive mode. Mo fa'ata'ita'iga fa'aola ta'itasi, o le fa'ailo lipid o le ogatotonu lea o fua tuto'atasi e tolu.
E pei ona faʻamatalaina i le (31), o sela (800 × 107) o loʻo faʻaalia ai le Gas1-GFP na faia i ai le immunoprecipitation masani. O le Gas1-GFP ua faʻamamaina na vavaeʻeseina e le SDS-PAGE ma faʻaliliuina i totonu o se membrane polyvinylidene fluoride (PVDF). Na vaʻaia le porotini e ala i le valiina o le PVDF i le amide black. O le fusi Gas1-GFP na tipi ese mai le PVDF ma fufuluina faʻalima i le methanol ma le tasi i le vai chromatography-MS (LC-MS). I le faʻasusuina o le membrane strip i le 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer ma le 500μl fou faʻasusu 1 M sodium nitrite mixture i le 37°C mo le 3 itula, o le lipid fraction e faʻasaʻolotoina mai le Gas1-GFP ma faʻasaʻolotoina. Faʻasaʻolotoina o le inosine phosphate ceramide i le va o le glucosamine ma le inositol (51). A maeʻa lena, ona fufuluina lea o le fasi membrane fa taimi i le vai LC-MS, faʻamago i le vevela o le potu, ma teuina i totonu o se ea nitrogen i le -80°C seʻia oʻo i le taimi e faia ai le suʻesuʻega. I le avea ai ma se faʻataʻitaʻiga faʻatonutonu, o se faʻataʻitaʻiga gaogao o le PVDF membrane na faʻaaogaina mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi. O le lipid na maua mai le Gas1-GFP na suʻesuʻeina lea e le MS e pei ona faʻamatalaina (50). I se aotelega, o fasi PVDF o loʻo i ai le GPI-lipid na toe faʻasusuina i le 75μl negative mold solvent [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] ma pasia le electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). I lenei tulaga, na maua ai faʻamatalaga MS i le negative ion mode.
E pei ona ta'ua muamua, o le vaega o lipid o le GPI anchor sa vavae'eseina mai le [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Sa vaevaeina lipids e ala i le chromatography manifinifi e fa'aaoga ai se solvent system (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) ma va'aia e fa'aaoga ai le FLA-7000 (Fujifilm).
O sela o loʻo faʻaalia ai le Gas1-GFP (600 × 107) na fufuluina faalua i le TNE buffer faatasi ai ma le TNE buffer, ma gauia i ni tioata, ona faʻa-centrifuge lea e aveese ai otaota o le sela ma tioata. Ona faʻa-centrifuge lea o le supernatant i le 17,000 kalama mo le 1 itula i le 4°C. Na fufuluina le pellet i le TNE ma faʻa-infused i le 1 U PI-PLC (Invitrogen) i le TNE o loʻo i ai le 0.2% digitalis saponin mo le 1 itula i le 37°C. A maeʻa le togafitiga o le enzyme, ona aveese lea o le membrane e ala i le centrifugation i le 17,000 kalama i le 4°C mo le 1 itula. Ina ia immunoprecipitate Gas1-GFP, na faʻa-infused le supernatant i le GFP-Trap_A (ChromoTek) i le 4°C i le po atoa. O le Gas1-GFP ua faʻamamaina na vavaeʻeseina e le SDS-PAGE na valiina i le Coomassie brilliant blue. Sa tipi ese le fusi valivali Gas1-GFP mai le lanu efuefu o loʻo siomia ai le aqueduct, ona maeʻa lea o le alkylation ma le iodoacetamide ma le faʻaitiitia i le dithiothreitol, ona faia lea o le in-gel digestion ma le trypsin. Aveese ma faʻamago peptides tryptic ma peptides ma GPI-glycans. O le peptide mago sa faʻafefiloi i le 20 μl o le vai. Tui se vaega (8μl) i totonu o le LC. O se koluma octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; lautele i totonu 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Iapani) sa faʻaaogaina e vavaeʻese ai peptides i lalo o tulaga faʻapitoa o le gradient. O le vaega feaveaʻi o le solvent A (0.08% formic acid) ma le solvent B (0.15% formic acid i le 80% acetonitrile). O le faiga o le Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) na faʻaaogaina e faʻamamā ai le koluma i le solvent A i totonu o le 55 minute i le fua faatatau o le tafe o le 50 μl min-1 mo le 5 minute, ona faʻateleina lea o le malosi o le solvent B i le 40%. , Iunaite Setete). O le eluate sa faʻaauau pea ona faʻaofiina i totonu o le puna o le ion ESI, ma o peptides tryptic ma peptides ma GPI-glycans sa suʻesuʻeina e le LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). I le seti MS, o le voltage o le puna o le capillary sa setiina i le 4.5 kV, ma o le vevela o le capillary transfer sa tausia i le 300°C. O le voltage capillary ma le voltage o le tube lens sa setiina i le 15 V ma le 50 V, i le faasologa. Na maua faʻamatalaga MS i le tulaga lelei o le ion (resolution o le 60,000; saʻo o le mamafa o le 10 vaega i le miliona) i le vaega o le mamafa o le 300/m/z fua faatatau o le mamafa/momi (m/z) 3000. O faʻamatalaga MS/MS e maua e ala i le ion trap i le LTQ Orbitrap XL [o numera muamua e 3 e faʻalagolago i ai faʻamatalaga, collision induced dissociation (CID)].
Sa faia fa'ata'ita'iga MD e fa'aaoga ai le polokalama GROMACS (52) ma le MARTINI 2 force field (53-55). Ona fa'aaoga lea o le CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) e fausia ai se bilayer o lo'o i ai le dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) ma le Cer C18 po'o le DOPC ma le Cer C26. O le topology ma fa'amaopoopoga o le Cer C26 e maua mai le DXCE e ala i le aveeseina o ni beads fa'aopoopo mai le si'usi'u sphingosine. Faaaoga le faiga o lo'o fa'amatalaina i lalo e paleni ai le vaega lua ma fa'agaoioia, ona fa'aaoga lea o fa'amaopoopoga mulimuli o le faiga e fausia ai se faiga o lo'o i ai le Emp24. O le vaega transmembrane o le yeast Emp24 (toega 173 i le 193) na fausia o se α-helix e fa'aaoga ai le fausaga molecular o le meafaigaluega MD (VMD) (58). Ona, a mae'a ona aveese lipids e fe'avea'i, sa fa'apipi'i fa'atasi le porotini ma fa'aofi i totonu o le bilayer e fa'aaoga ai le CHARMM GUI. O le faiga mulimuli e aofia ai le 1202 DOPC ma le 302 Cer C26 po'o le 1197 DOPC ma le 295 Cer C18 ma le Emp24. Fa'a-ionize le faiga i se tulaga maualuga e 0.150M. E fa fa'ata'ita'iga tuto'atasi na faia mo ni fa'atulagaga lua o le bilayer.
O le lipid bilayer e fa'apaleniina e fa'aaoga ai le faiga o le CHARMM GUI, lea e aofia ai le fa'aitiitia ma le fa'apaleniina o la'asaga e 405,000, lea e fa'aitiitia malie ai ma ave'esea ai tapula'a o tulaga, ma fa'ateleina le la'asaga taimi mai le 0.005 ps i le 0.02 ps. A mae'a ona fa'apaleniina, e gaosia ai le 6 µs ma le la'asaga taimi o le 0.02 ps. A mae'a ona fa'aofi le Emp24, fa'aaoga le faiga lava e tasi o le CHARMM GUI e fa'aitiitia ai ma fa'apaleni ai le faiga, ona fa'agaoioi lea mo le 8 sekone i le gaosiga.
Mo faiga uma, i le taimi o le faagasologa o le paleni, o le mamafa e pulea e le Berendsen barostat (59), ma i le taimi o le faagasologa o le gaosiga, o le mamafa e pulea e le Parrinello-Rahman barostat (60). I tulaga uma, o le mamafa averesi e 1 pa ma o se semi-isotropic pressure coupling scheme e faʻaaogaina. I le faagasologa o le paleni ma le gaosiga, o se thermostat (61) ma le toe faʻatulagaina vave e faʻaaogaina e faʻapipiʻi ai le vevela o le porotini, lipid ma solvent particles. I le taimi atoa o le faʻagaioiga, o le vevela faʻamoemoeina e 310K. O le fegalegaleaiga e le o le fusifusia e fuafuaina e ala i le faia o se lisi faʻapipiʻi e faʻaaoga ai le Verlet scheme ma le 0.005 buffer tolerance. O le Coulomb term e fuafuaina e faʻaaoga ai le reaction field ma se cut-off distance o le 1.1 nm. O le Vander Waals term e faʻaaogaina se cut-off scheme ma se cut-off distance o le 1.1 nm, ma o le Verlet cut-off scheme e faʻaaogaina mo le potential drift (62).
I le fa'aaogaina o le VMD, o le umi e tipi ese ai le galu i le va o DOPC phosphate beads po'o ceramide AM1 beads ma le porotini e 0.7 nm, ma o le aofa'i o lipids e fegalegaleai ma le porotini e fuafuaina. E tusa ai ma le fua fa'atatau o lo'o mulimuli mai, fuafua le depletion-enrichment (DE) factor e pei ona i ai i le (63): DE factor = (le aofa'i o lipids uma i le porotini 0.7) i le porotini 0.7 (le aofa'i o Cer i lipids uma)
O le tau na lipotia mai e maua o se averesi, ma o pa sese o ni kopi tutoatasi e fa o le SE. O le taua fa'amaufa'ailoga o le DE factor e fuafuaina e ala i le t test [(averesiDE-factor-1)/SE]. Fuafua le tau P mai le tufatufaga e tasi le si'usi'u.
Sa fa'aaogaina le meafaigaluega GROMACS e fuafua ai le fa'afanua o le mafiafia 2D o le faiga o lo'o i ai le Emp24 i totonu o le 250 ns mulimuli o le trace. Ina ia maua le fa'afanua o le fa'aleleia/fa'aitiitia o le ceramide, o le fa'afanua o le mafiafia o le Cer e vaevaeina i le aofa'i o le fa'afanua o Cer ma le DOPC, ona vaevaeina lea i le maualuga o le Cer i le tino. O le fua fa'atatau lava lea o le fa'afanua lanu e tasi e fa'aaogaina.
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O le ata 3D maualuga le iugafono i le taimi moni e faʻaalia ai le taua o le umi o le filifili ceramide mo le faʻavasegaina o porotini i nofoaga filifilia e maua mai ai.
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O le ata 3D maualuga le iugafono i le taimi moni e faʻaalia ai le taua o le umi o le filifili ceramide mo le faʻavasegaina o porotini i nofoaga filifilia e maua mai ai.
©2020 American Association for the Advance of Science. aia tatau uma ua taofia. AAAS ose paaga a HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ma COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.