Faafetai mo le asiasi mai i le Nature.com. O le lomiga o le browser o loʻo e faʻaaogaina e itiiti le lagolago mo le CSS. Mo le poto masani sili ona lelei, matou te fautuaina oe e faʻaaoga se browser ua faʻafouina (pe tape le compatibility mode i le Internet Explorer). I le taimi nei, ina ia mautinoa le faʻaauauina o le lagolago, o le a matou faʻaalia le 'upega tafaʻilagi e aunoa ma ni sitaili ma JavaScript.
E le pei o manu e ivi tua, o iniseti e manatu lautele e leai ni homone steroid feusuaiga e fa'aitu'au i tane. I le Anopheles gambiae, o le ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) e foliga mai na atia'e e pulea ai le atina'eina o fuamoa pe a fa'aputuina e fafine2 ma fa'aosofia ai se vaitaimi e le mafai ai ona fa'aipoipo pe a fa'afeusuaiga e tane3. Talu ai o le atina'eina o fuamoa ma le fa'aipoipo o ni uiga taua o le toe fanauina, o le malamalama i le auala e fa'apipi'i ai e namu fafine Anopheles nei fa'ailoilo hormonal e mafai ona fa'afaigofie ai le mamanuina o polokalame fou e pulea ai le malaria. O iinei, matou te fa'aalia ai o nei galuega toe fanauina e fa'atonutonuina e steroid feusuaiga eseese e ala i se feso'ota'iga faigata o enzymes ecdysteroid-activating/inactivating. Na matou fa'ailoaina se ecdysone oxidized fa'apitoa mo tane, 3-dehydro-20E (3D20E), lea e puipuia ai matua e ala i le tapunia o le taliaina o feusuaiga a fafine pe a uma ona fa'afeusuaiga ma fa'agaoioia e le dephosphorylation. E taua tele, o le fa'aliliuina o le 3D20E na fa'aosofia ai fo'i le fa'aalia o genes toe fanauina e fa'atumauina ai le atina'eina o fuamoa i le taimi o le fa'ama'i Plasmodium, ma fa'amautinoa ai le soifua maloloina o fafine ua a'afia. O le 20E e maua mai i fafine e le fa'aosofia ai se feusua'iga tali atu, ae fa'atagaina ai tagata ta'ito'atasi e faiaiga e fofoa fuamoa pe a uma ona taofia kinases 20E-inhibiting. O le fa'ailoaina o lenei hormone steroid iniseti fa'apitoa mo tane ma lona matafaioi i le fa'atonutonuina o le taliaina o feusuaiga a fafine, le fanautama ma le fegalegaleaiga ma le Plasmodium ua fautua mai ai le gafatia e fa'aitiitia ai le manuia o le fanautama o namu e feavea'i le malaria.
O loʻo toe faʻatupulaʻia foʻi mataupu o le Malaria ma le oti4 ona o le teteʻe lautele o namu Anopheles i vailaʻau faʻasaina iniseti, o le na o le pau lea o le auala e feaveaʻi ai siama o le malaria i tagata. O le faʻaipoipo o nei namu o se sini mataʻina mo ni togafitiga fou e pulea ai le malaria auā e naʻo le faʻatasi le faʻaipoipo o fafine5; o le faia o lenei faʻaipoipoga e tasi e leai se avanaga o le a tele ai le gafatia e faʻaitiitia ai le faitau aofaʻi o namu i le fanua.
E lē mafai e fafine ona faia feusuaʻiga pe a uma ona maua ni homone steroid e maualuga le titer mai alii. Ua faaalia i suʻesuʻega o le mea e faigata ai ona toe faia feusuaʻiga o le 20-hydroxyecdysone (20E), o se hormone steroid e sili atu ona lauiloa o se faʻatonutonu o le taamilosaga o le molting i le tulaga o le larval. O le gafatia o tane e faʻapipiʻi ma faʻaliliuina le 20E ua faʻatupulaʻia faapitoa i ituaiga Anopheles o se vaega o le subgenus Cellia7, lea e salalau i Aferika ma e aofia ai avefeʻau sili ona mataʻutia o le malaria, e aofia ai le Anopheles gambiae. E tāua tele lenei mea ona i nei ituaiga fafine e gaosia foʻi le 20E pe a uma ona 'ai toto, ma e faʻatautaia e le 20E le taamilosaga oogenesis (tagai i le ref. 8). Peitaʻi, e itiiti se mea e iloa e uiga i le auala e faʻapipiʻi ai e fafine faʻailoilo mai ni puna eseese se lua o le ecdysone (fesiitaiga o tane ma le faʻaosofiaina o le fafagaina o le toto) e aunoa ma le faʻaleagaina o lo latou lava gafatia e faia feusuaʻiga. O le mea moni, afai o le 20E e gaosia e fafine e mafua ai le lē mafai ona faia feusuaʻiga, o le a iʻu ai i le lē fanautama i tagata e fafagaina taupou, o se amioga masani i nei namu5.
O se faʻamatalaga e ono mafai ona fai, o le A. gambiae tane e faʻaliliuina atu se ecdysone faʻapitoa mo tane ua suia, lea e faʻagaoioia ai se faʻasologa o faʻailoilo i totonu o le auala fanautama a fafine, ma iʻu ai i le le mautu o le feusuaʻiga. Peitaʻi, e ui o vertebrates e tele a latou homone steroid, e pei o le estrogen ma le androgen (toe iloiloina i le ref. 9), i lo matou iloa, e leʻi iloa ni steroids e faʻalagolago i le androgenic i iniseti.
Na matou fa'atulaga e fuafua le lisi o hormones steroid i le tane male accessory gland (MAG) o le A. gambiae ua matutua fa'afeusuaiga i le sailiga o steroids e mafai ona suia. I le fa'aaogaina o le high performance liquid chromatography fa'atasi ai ma le tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) nai lo le metotia e le'i fa'apitoa na fa'aaogaina muamua, na matou iloa ai le ecdysone (E) ma le 20E i totonu o lenei a'ano, ma fa'amaonia ai le taunuuga muamua. Peita'i, o le fa'ata'ita'iga na pulea e steroids phosphorylated oxidized, e ogatasi ma le fua fa'atatau 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Ata 1). O isi foliga e aofia ai le 3-dehydro-20E (3D20E) ma le 20E-22-phosphate (20E22P). O le malosi o le fa'ailo HPLC-MS/MS o le 3D20E22P e lua fa'atonuga o le tele e maualuga atu nai lo lona foliga dephosphorylated, 3D20E, ma tolu fa'atonuga o le tele e maualuga atu nai lo le E ma le 20E (Ata 1). E ui i isi vaega o le tino ma le vaega pito i lalo o le ala fanautama (LRT; Fa'amatalaga Fa'alautele Ata 1a). Na matou iloiloina fo'i ecdysteroids i tane ma fafine fou tapunia (<1 aso le matutua) ma na iloa ai le 3D20E ma le 3D20E22P i le MAG; E, 20E ma le 20E22P na i ai i itupa uma e lua (Fa'amatalaga Fa'alautele Ata 1b). O nei fa'amaumauga e fa'ailoa mai ai o tane matutua o le A. gambiae e gaosia ni titers maualuga o hormones fa'aleleia i a latou MAGs e le fa'aputuina e fafine.
O le MAG ma le LRT fafine (e aofia ai le atria, seminal vesicles, ma le parovarium) na vaevaeina mai tane taupou e 4-aso le matutua (4-aso le matutua) ma fafine taupou ma fafine ua fa'aipoipo (0.5, 3, ma le 12 hpm). O le Ecdysone i nei a'ano na su'esu'eina e le HPLC-MS/MS (averesi ± sem; suega-t e le'i fa'aipoipoina, itu e lua, fua faatatau o le iloa sese (FDR) ua fa'asa'oina; NS, e le taua; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 itula vs. 0.5 itula, P = 0.035; 12 itula vs. 3 itula, P = 0.0015; 12 itula vs. 0.5 itula, P = 0.030. 3D20E22P: 3 itula vs. 0.5 itula, P = 0.25; 12 itula vs. 3 itula, P = 0.0032; 12 itula vs. 0.5 itula, P = 0.015). O faʻamaumauga e mai ni faʻataʻitaʻiga faʻaolaola se tolu. O le tumutumuga o le eria mo ecdysone taʻitasi e fiafia i ai na fuafuaina ma faʻatulagaina e ala i le aofaʻi o namu. O le Ecdysone o loʻo faʻatusalia e lanu e pei ona taua i lalo: E, lanumeamata; 20E, moli; 20E22P, violē; 3D20E, lanumoana; 3D20E22P, piniki. O le faʻaopoopoga e faʻateleina ai le fua i luga o le y-axis e faʻaalia ai le maualalo o le ecdysone.
Ina ia suʻesuʻeina pe na fesiitaʻi le 3D20E22P ma le 3D20E i le taimi o le feusuaʻiga, na matou vaevaeina ai fafine LRT i taimi eseese ina ua maeʻa le feusuaʻiga. E ui lava e leʻi maua le ecdysone i fafine taupou, ae na matou matauina le tele o le 3D20E22P i le LRT i le taimi lava na maeʻa ai le feusuaʻiga (0.5 itula talu ona feusuaʻi, hpm), ma faʻaitiitia i le aluga o taimi, aʻo faʻateleina tele le maualuga o le 3D20E (Ata 1). I le faʻaaogaina o le 3D20E na faia faʻakemikolo e fai ma faʻataʻitaʻiga, na matou iloa ai o le maualuga o lenei hormone steroid i LRT feusuaʻiga e le itiiti ifo i le 100-fold le maualuga nai lo le 20E (Extended Data Table 1). O le mea lea, o le 3D20E22P o le tane ecdysone autu lea e fesiitaʻi atu i le fafine LRT i le taimi o le feusuaʻiga, ma o lona foliga dephosphorylated, 3D20E, e matua tele lava i le taimi lava na maeʻa ai le feusuaʻiga. O lenei mea e faʻaalia ai se matafaioi taua mo le ecdysone mulimuli i le biology o fafine pe a uma le feusuaʻiga.
Ina ua maeʻa ona faia se faʻamaumauga fou o le RNA sequencing (RNA-seq) (Ata 2a), faʻaaoga se paipa bioinformatics na fausia faʻapitoa, na matou sailia le ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ma le ecdysone encoding 20E-modified phosphatase gene. O le EPP) o loʻo faʻaalia i totonu o aʻano o le toe fanautama. Na matou faʻailoaina se tasi sui tauva EPP gene ma ni EcK genes se lua e ono mafai (EcK1 ma EcK2), ae leʻi mafai ona maua se sui tauva EO gene lelei. E taua tele, o genes EPP taʻitasi na faʻaalia i tulaga maualuga (98.9th percentile) i Gambian MAGs ae le o LRT fafine (Ata 2b), e feteenai ma o matou faʻamoemoega talu ai na tupu le dephosphorylation o le 3D20E22P i totonu o lenei aʻano fafine. O le mea lea, matou te talitonu o le EPP tane e ono faʻaliliuina i le taimi o le faʻaipoipoga. O le mea moni, na matou faʻaaogaina le in vivo stable isotope labeling e ufiufi ai le porotini fafine pe a uma le faʻaipoipoga, o se enzyme na faʻailoa e le MS i le atrium fafine (Ata 2c ma le Supplementary Table 1). O le iai o Sa fa'amaonia fo'i le EPP i le MAG ma le LRT fafine ua fa'aipoipo (ae le o se taupou) e fa'aaoga ai ni antibodies fa'apitoa (Ata 2d).
a, O se paipa fa'akomepiuta fa'apitoa ua fausia e su'e ai a'ano o le toe fanautama o itupa ta'itasi mo ni kenera o lo'o fa'ailoa mai ai EcKs, EOs, ma EPPs. O numera i tafatafa o aū e fa'ailoa mai ai le aofa'i o sui tauva tane ma fafine i la'asaga ta'itasi. O lenei au'ili'iliga na fa'ailoa mai ai le tasi le kenera EPP (EPP) ma le tasi le kenera EcK (EcK1) o lo'o fa'aalia i tane, ma le tasi le kenera EcK (EcK2) o lo'o fa'aalia i itupa uma e lua ae le maua ai se kenera EO sui tauva. b, Heatmap e fa'atusatusa ai le fa'aalia o le kenera sui tauva i totonu o a'ano o le taupou (V) ma le fa'aipoipo (M) Anopheles gambiae ma Anopheles albicans. Spca, fa'asusuina; MAGs, glands fesoasoani i tane; isi vaega o le tino, e aofia ai susu, apaʻau, vae, tino gaʻo, ma totoga i totonu i itupa uma e lua, ma ovaries i fafine. E maualuga le faʻaalia o le EcK2 i le MAG ma le atria o Gambia, ae o le EPP e naʻo le MAG e maua ai.c, Suʻesuʻega Proteomic o le translocation o le vaega ejaculate tane i totonu o le atria fafine i le 3, 12 ma le 24 hpm, o loʻo faʻaalia ai le 67 sili ona tele o porotini. Sa tausia fafine i luga o se taumafataga o loʻo i ai le 15N e faʻailoga ai (ma ufiufi) porotini uma. O tane e leʻi faʻailogaina na faʻaipoipoina ma fafine faʻailogaina, ma o fafine LRT na vaevaeina i le 3, 12 ma le 24 hpm mo le suʻesuʻega proteomic (tagai i le Supplementary Table 1 mo se lisi atoa o porotini ejaculatory). Inset, EPP, Eck1 ma EcK2 na iloa i le MAG o tane taupou e ala i le suʻesuʻega proteomic o nei aano.d, EPP na iloa e le western blot i le MAG ma le LRT o fafine faʻaipoipo, ae le o fafine taupou poʻo tane poʻo le vaega atoa o le tino o le fafine. Sa faʻatasi ona faʻapipiʻi membranes su'esu'eina i le anti-actin (pulea o le uta) ma le anti-EPP antibodies. O tane uma o taupou. Tagai i le Ata Faaopoopo 1 mo fa'amatalaga puna o le gel. Sa faia faalua Western blots ma taunuuga tutusa.
O le gaioiga o le ecdysteroid phosphophosphatase o le EPP na faʻamaonia ina ua maeʻa ona faʻatupuina e le HPLC-MS/MS faʻatasi ai ma le 3D20E22P na vavaeʻeseina mai le MAG (Extended Data Fig. 2a). E le gata i lea, ina ua matou faʻafilemuina le EPP e ala i le faʻalavelave faʻafuaseʻi a le RNA (RNAi), na matou iloa ai se faʻaitiitia tele o le gaioiga o le phosphatase i totonu o aʻano toe fanau o nei tane (Ata 3a), ma o fafine na faʻaipoipo ma tane na faʻafilemuina e le EPP na faʻaalia ai le maualalo tele o le vaega o le 3D20E na faʻaitiitia le phosphorylated (Ata 3b) e ui lava i le faʻafilemuina faʻapitoa o gene (Extended Data Fig. 2b,c). I se faʻatusatusaga, matou te leʻi iloa ni suiga taua i le fua faatatau o le 20E22P/20E i namu lava e tasi, lea e ono faʻaalia ai o le enzyme e faʻapitoa mo le 3D20E22P (Ata 3b).
a, Fa'aitiitia le gaioiga o le phosphatase i le MAG na mafua mai i le fa'afilemuina o le EPP e fa'aaoga ai le EPP RNA (dsEPP) po'o le GFP RNA (dsGFP) fa'atonutonu. E luasefulu vaita'ele MAG na fa'aaogaina i fa'ata'ita'iga ta'itasi (P = 0.0046, paired t-test, t-itu), o lo'o fa'atusalia e ni togitogi eseese. b, O fafine na fa'aipoipo ma tane na fa'afilemuina le EPP e maualalo tele le vaega o le 3D20E na fa'aitiitia le phosphorylated i le 3 hpm (P = 0.0043, unpaired t-test, t-itu), ae o le 20E e le'i a'afia (P = 0.063, unpaired). t-test, itu-lua). O faʻamaumauga o loʻo tuʻuina atu o le averesi ± sem mai vaega e tolu o fafine e 13, 16 ma le 19 taʻitasi.c, O fafine na faʻaipoipo ma tane na taofia e le EPP e maualuga tele le fua faatatau o le toe faʻaipoipo (P = 0.0002, Suʻega saʻo a Fisher, itu-lua). Na muamua faʻamalosia fafine e faʻaipoipo e faʻamautinoa ai lo latou tulaga faʻaipoipo; I le 2 aso mulimuli ane, na faʻafesoʻotaʻi ai i latou ma isi tane o loʻo tauaveina ni sperm transgenic e iloilo ai le fua faatatau o le toe faʻaipoipo e ala i le quantitative PCR detection o le transgene.d, O fafine na fafagaina i le toto na faʻaipoipo ma tane na faʻalologoina e le EPP na matua faʻaitiitia le fanautama (P < 0.0001; Mann-Whitney test, itu-lua) ma faʻaitiitia teisi le numera o fuamoa (P = 0.088, Mann-Whitney test, itu-lua), ae leʻi afaina le fua faatatau o le fanautama (P = 0.94, Fisher's saʻo test, itu-lua).I paneli uma, o le n o loʻo faʻatusalia ai le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga o namu tutoʻatasi faʻaola.NS, e le taua.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Sosoo ai, na matou iloiloina pe taua le ecdysone dephosphorylation mo le faʻaosofiaina o le teteʻe i feusuaʻiga i fafine. E maitauina, o fafine na feusuaʻi ma tane ua leai le EPP na toe feusuaʻi i se taimi maualuga atu (44.9%) nai lo fafine pulea (10.4%) pe a faʻaalia i isi tane (transgenic) (Ata 3c). Na matou matauina foi se faʻaitiitia tele o le fanautama (Ata 3d, agavale) ma se faʻaititia teisi o le aofaʻi o fuamoa na fofoa e nei fafine (Ata 3d, ogatotonu), ae o le pasene o fuamoa na fofoa e fafine (o le isi tali na mafua mai i fafine e ala i feusuaʻiga)) e leʻi afaina (Ata 3d, taumatau). Ona o le faʻapitoa na matauina o le EPP mo le 3D20E22P, o nei taunuuga e fautua mai ai o le faʻagaoioia o le 3D20E e le EPP na faʻaliliuina i le taimi o feusuaʻiga atonu e iai sona sao taua i le tapeina o le taliaina e fafine o isi feusuaʻiga, o se amioga na muamua mafua mai i le fesiitaiga faʻafeusuaiga o le 20E. O le mea lea, o lenei hormone faʻapitoa mo tane e aʻafia ai foʻi le fanautama o fafine.
Sosoo ai, na matou faʻatusatusaina gaoioiga a le 20E ma le 3D20E i faʻataʻitaʻiga tui i taupou ua matutua faʻafeusuaiga e faʻaaogaina ai le 3D20E ua faia i vailaʻau (Ata 4a–c) ma le 20E o loʻo maua faʻapisinisi. Na matou matauina o le 3D20E sa sili atu le aoga nai lo le 20E i le tapunia o le lagona o fafine i le faʻaipoipo i tulaga uma e lua (Ata 4d). E taua tele, o le afa o le tulaga faʻaletino o le 3D20E i le LRT (1,066 pg pe a uma ona tui vs. 2,022 pg pe a uma ona faʻaipoipo) na mafua ai se vaega o fafine e le mafai ona faʻaaogaina le vailaʻau lea e 20-fold maualuga atu nai lo le tulaga faʻaletino o le 20E (361 pg pe a uma ona tui) 24 itula talu ona tuiina i le maualuga maualuga o le 18 pg pe a uma ona faʻaipoipo; Fa'amaumauga Fa'alauteleina Laulau 1). O lenei taunuuga e ogatasi ma le manatu e fa'apea, o le fesiitaiga fa'afeusuaiga o le 20E e le mafua ai ni vaitaimi e le fiafia ai i feusua'iga, ma fa'asino atili ai i le 3D20E o se mea taua i le fa'amautinoaina o le mafutaga a matua ma le tamaititi. Sa sili atu fo'i le malosi o le 3D20E nai lo le 20E i su'ega o fuamoa i fafine taupou (Ata 4e), ma fa'ailoa mai ai o le fua masani o fuamoa na matou matauina ina ua mae'a le fa'alologo fa'aitiitiga o le EPP ona o le i ai o le gaioiga o le 3D20E o lo'o totoe o lo'o gaosia pea e mea fa'atupu fa'aipoipoga a fafine.
(a,b) 3D20E na fa'asu'iina fa'akemikolo mai le 20E (a) ma le liua/lelei tele (fa'amaumauga o lo'o tu'uina atu o le averesi ± sem mai ni tali tuto'atasi se tolu o le fa'asu'iina) (b).c, O le tele o le fusi (afa pito i lalo) e tutusa lelei ma le ecdysone o lo'o maua i le LRT fafine ua fa'aipoipoina (afa pito i luga).d, Fa'atusatusa i le 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Su'ega sa'o a Fisher, itu-lua) ma le 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Su'ega sa'o a Fisher, itu-2), ae o le 20E e sili atu le maualuga nai lo le fa'atonutonu i fua maualuga (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Su'ega sa'o a Fisher, itu-2).e, O le tuiina o le 3D20E na mafua ai ona maualuga tele le fua faatatau o le fanautama i tama'ita'i taupou nai lo le 10% o vaega e pulea i le ethanol (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Su'ega sa'o a Fisher, itu-lua), ae o le 20E pe a fa'atusatusa i vaega e pulea na'o i fua maualuga (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Su'ega sa'o a Fisher, itu-lua). Na mafua ai ona maualuga tele le fua faatatau o le fanautama a le 3D20E nai lo le 20E i fua maualuga (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Su'ega sa'o a Fisher, itu-lua). I vaega uma, o le n o lo'o fa'atusalia ai le aofa'i o fa'ata'ita'iga o namu tuto'atasi fa'aola. NS, e le taua. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. O fa'amaumauga e mai ni kopi se tolu.
I suʻesuʻega ua mavae, na matou iloa ai o le fesiitaiga faʻafeusuaiga o hormones steroid e faʻaosofia ai le faʻaalia o le MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), o se gene fanautama fafine e puipuia ai fafine A. gambiae mai le faʻamaʻi pipisi o le P. falciparum. Tau o le soifua maloloina e mafua mai i le 13, o le parasite malaria sili ona mataʻutia i tagata. Ona o le taua o le MISO i le malosi o le fanautama o Anopheles i nofoaga e maua ai le malaria, na matou filifili ai e iloa po o le fea hormone 3D20E poʻo le 20E e faʻaosofia ai le faʻaalia o lenei gene. Na matou iloa ai e ui o le tuiina o le 20E e faʻapitoa pe sili atu ona malosi e faʻaosofia ai nisi o receptors hormone nuclear (HR), e pei o le HR3 ma le HR4, ma faʻamoemoega masani o steroid i lalo ifo, e pei o genes yolkogenic Vg14, 15, 16, o le MISO e sili atu le malosi na faʻaosofia e le 3D20E (Extended Data Fig. 3). O le mea lea, o le fesiitaiga faʻafeusuaiga o lenei hormone steroid androgenic e foliga mai e faʻaosofia ai ni auala e puipuia ai fafine mai tau e mafua mai i faʻamaʻi pipisi. E le gata i lea, o le 3D20E e aʻafia eseese ai isoforms uma e lua o le O le E receptor EcR, e faʻaosofia ai le EcR-A ma taofia ai le EcR-B, ma sili atu ona faʻaosofia ai isi genes e faʻaosofia ai le faʻaipoipoga, e aofia ai le HPX15, lea e aʻafia ai le fanautama o fafine. E mafai ona faʻamatalaina ai le tele o le le fanautama na matauina i fafine na faʻaipoipo ma tane e leʻi faʻalologoina e le EPP (Faʻamatalaga Faʻalauteleina Ata 3). O nei faʻamaumauga e fautua mai ai le i ai o auala i lalo ifo e faʻamalosia e ni hormones e lua ecdysone atonu e mafua ai le galuega faʻapitoa i itupa.
Sosoo ai, na matou faʻataʻitaʻiina le galuega a genes EcK e lua na faʻailoa mai i la matou pipeline bioinformatics. O le faʻafilemuina o le EcK1 poʻo le EcK2 na mafua ai le tele o le oti i tane (Extended Data Fig. 4a), ma faʻailoa mai ai o le ecdysone phosphorylation, ma o lea e le faʻagaoioia ai, e taua mo le ola. Talu ai ona o le EcK2 na faʻaalia i tulaga maualuga atu nai lo le EcK1 ma na iloa i MAGs e ala i le proteomics (Fig. 2b,c ma le Supplementary Table 2), na matou faʻamaonia ai lona gaioiga ecdysteroid kinase e ala i le faʻatupuina i le 20E, lea na mafua ai le phosphorylation 20E22P (Extended Data Figure 2).4b). A faʻaaogaina le 3D20E o se substrate, na matou le mafai ona iloa le oloa phosphorylated 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), ma faʻailoa mai ai o le 20E nai lo le 3D20E atonu o le sini sili ona lelei mo le EcK2.
E tusa ai ma la matou suʻesuʻega RNA-seq, sa maualuga foʻi le faʻaalia o le EcK2 i le LRT o fafine taupou, lea na tapeina ai ina ua maeʻa le feusuaʻiga (Ata 2b). Na matou faʻamaonia nei faʻamaumauga ma iloa ai e leʻi aʻafia le faʻaalia o le EcK2 i le fafagaina o le toto (Faʻamatalaga Faʻalautele Ata 5a). I le faʻalauteleina o a matou suʻesuʻega muamua o le MS, na matou iloa ai o le tumutumuga o le 20E22P e fesoʻotaʻi vavalalata ma le tumutumuga o le 20E (22-26 itula talu ona uma le taumafataga o le toto; Faʻamatalaga Faʻalautele Ata 5b). O le faʻafilemuina o le EcK2 i fafine taupou na mafua ai le faʻateleina o le 3-fold i le fua faʻatatau o le 20E i le 20E22P i le 26 itula talu ona uma le taumafataga o le toto (Faʻamatalaga Faʻalautele Ata 2c ma le 5c), ma faʻamaonia ai o le EcK2 e faʻaphosphorylates foʻi le 20E i fafine. E taua tele, o taupou ua uma le EcK2 na faʻatumauina le taliaina atoatoa o feusuaʻiga (Faʻamatalaga Faʻalautele Ata 5d,e), ma faʻapea mai ai o le gaosiga o le 20E e fafine e le faʻaosofia ai vaitaimi e le fiafia ai feusuaʻiga. Peitaʻi, o nei fafine sa matuā fa’ateleina ai fua o le fofoa o fuamoa pe a fa’atusatusa i isi vaega, ma e silia ma le 30% o taupou na fofoa fuamoa (Extended Data Fig. 5f). Afai na faia tui Eck2 RNA (dsEcK2) e lua manoa pe a uma ona fafagaina i le toto, e le’i tupu le fanautama, ma o le taimi lea na fa’aitiitia ai le tumutumuga o le 20E ona o le foloina o le toto. I le aotelega, o nei taunuuga e lagolagoina ai se fa’ata’ita’iga e mafai e le 20E na gaosia pe a uma ona mitiia le toto ona fa’aosofia ai le fanautama, ae na’o le taimi lava e tape ai le poloka fanautama (EcK2 ma atonu o isi mea) ona o le fa’aipoipoga. E le’i taofia e tui 20E po’o le 3D20E le fa’aalia o le EcK2 i taupou (Extended Data Fig. 5g), ma fa’ailoa mai ai o isi mea e fa’alavelaveina ai le taofia o lenei kinase. Peita’i, o le maualuga o le 20E pe a uma ona fafagaina i le toto e le lava e fa’aosofia ai le le to’a o le fa’aipoipoga, ae na fa’aosofia lelei e le maualuga o le titers o le 3D20E na fesiita’i fa’afeusuaiga.
O a matou taunuuga e maua ai ni malamalamaaga taua i auala e faʻatonutonuina ai le manuia o le toe fanauina o le A. gambiae. Ua aliaʻe mai se faʻataʻitaʻiga lea na atiaʻe ai tane e faʻapipiʻi ai ni titers maualuga o le 3D20E, o se ecdysone faʻapitoa mo tane e faʻamautinoa ai le matua e ala i le faʻaitiitia o lagona o fafine i nisi faʻaipoipoga. I le taimi lava e tasi, o nei vectors malaria ua latou atiaʻe foi se faiga lelei e faʻagaoioia ai le 3D20E i fafine e tali atu ai i le fesiitaiga faʻafeusuaiga o le EPP faʻapitoa mo tane. I lo matou iloa, o le faʻataʻitaʻiga muamua lea o se faiga o le hormone steroid e pulea e tane ma fafine e faia se galuega tulaga ese ma taua i iniseti. Ua faʻatulagaina le galuega ecdysone faʻapitoa mo tane ae e leʻi faʻaalia ma le mautinoa. Mo se faʻataʻitaʻiga, o se manatu e tele ina le faʻamaonia 18 o nei galuega e mafai ona faia e le 20E precursor E1. Ua lauiloa i le Drosophila, o le monandry e faʻaosofia e le fesiitaiga faʻafeusuaiga o peptides laiti o feusuaiga19,20 e fegalegaleai ma neurons e faʻamalosia ai le auala toe fanauina o fafine e ala i ni peptide receptors faʻapitoa mo feusuaiga21,22. E manaʻomia nisi galuega e fuafua ai le faʻailoilo i lalo. tafega o lo'o pulea e le 3D20E i fafine o le A. gambiae ma ia iloa ai pe mafai ona fa'asaoina nei tafega i le va o namu ma le Drosophila.
I le tulaga taua o le 3D20E i le fanautama ma amioga a fafine na faʻailoa mai i la matou suʻesuʻega, o auala e tau atu i le faʻatupuina ma le faʻagaoioia o le 3D20E e ofoina atu ai avanoa fou mo fuafuaga e pulea ai namu i le lumanaʻi, e pei o le gaosia o tane e le fanautama i fuafuaga faʻatekinolosi iniseti e le fanautama. Faʻaaoga mo le faʻasaʻolotoina o le vao poʻo le faʻataʻitaʻi i le 3D20E i taʻaloga taupou. Atonu na atiaʻe le galuega faʻapitoa a tane o le 3D20E ina ua maua e le A. gambiae ma isi ituaiga o Cellia le gafatia e faʻapipiʻi ai a latou semen i totonu o poloka faʻaipoipoga, aua e mafai ai ona faʻaliliuina lelei le tele o hormones ma enzymes e faʻagaoioia ai hormones. I le isi itu, o le evolusione 3D20E e faʻatinoina ai le monandry e maua ai se auala mo fafine (e ala i le faʻaalia maualuga o le MISO) e faʻaleleia ai lo latou malosi faʻafanau i vaega e maualuga le malaria, lea e fesoasoani faʻapitoa i le fesiitaiga o le Plasmodium. I le tulaga ua faʻaalia ai o le fafine 20E e iai ni aafiaga loloto i le ola ma le tuputupu aʻe o le P. falciparum i namu fafine Anopheles,24 o auala o le hormone steroid tane ma fafine ua avea nei ma vaega autu o fegalegaleaiga a namu ma parasite.
Sa tausia ituaiga iniseti o le A. gambiae G3 i lalo o tulaga masani o iniseti (26-28 °C, 65-80% le susu o le ea, 12:12 itula le malamalama/pogisa o le vaitaimi o ata). Sa fafagaina anufe i mea'ai i'a pauta (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ma Tetra Pond Sticks i le fua faatatau o le 7:7:2). Sa fafagaina namu matutua i le 10% dextrose solution ma le toto o le tagata i vaiaso ta'itasi (su'esu'e vaega o le toto). Sa maua namu taupou e ala i le vaevaeina o itupa i le tulaga o le pupal pe a uma ona su'esu'eina pito i tua e ala i le microscopy. O namu tane o lo'o tauaveina le DsRed transgene ua uma ona fa'amatalaina muamua.
Sa faia fa'ata'ita'iga fa'amalosia o feusua'iga e tusa ai ma fa'atulagaga ua uma ona fa'amatalaina. Mo feusua'iga masani, o tama'ita'i taupou e 4 aso le matutua sa tausia i le fua fa'atatau 1:3 ma tama'ita'i taupou ua matutua i feusua'iga mo po e lua. Mo fa'ata'ita'iga na tuiina ai tama'ita'i i le dsEPP, o le fa'apipi'iina fa'atasi o le cage sa tutusa ma aso 3-4 talu ona tuiina, lea na matuā taofia ai le gaioiga o le phosphatase (Fa'amatalaga Fa'alauteleina Ata 2b).
O aano o namu, tino maliu o totoe (vaega o totoe o le tino), po'o le tino atoa na vaevaeina i le 100% methanol ma fa'afefiloi i se beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 sekone). O aofa'iga o aano ma le aofa'i o le methanol e fa'apea: vaega o totoe o le tino, 50 i le 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; fafine LRT, 25–50 80 µl. O le mea na fa'aputuina na faia i ai se isi fa'a'esega methanol fa'atasi ai ma le aofa'i tutusa o le methanol. Na ave'esea otaota o sela e ala i le centrifugation. O le methanol mai fa'a'esega uma e lua na tu'ufa'atasia ma fa'amago i lalo o le tafe o le nitrogen, ona toe fa'asusu lea i le aofa'i nei o le 80% methanol i le vai: vaega o totoe o le tino, 50 µl; MAG ma fafine LRT, 30 µl.
Sa iloiloina faʻataʻitaʻiga i luga o le mass spectrometer (ID-X, Thermo Fisher) ua faʻapipiʻi i se meafaigaluega LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl o le faʻataʻitaʻiga na tuiina i luga o se koluma 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) na tausia i le 25 °C. O vaega feaveaʻi mo le LC o le A (vai, 0.1% formic acid) ma le B (acetonitrile, 0.1% formic acid). O le LC gradient e faʻapea: 5% B mo le 1 minute, ona faʻateleina lea i le 100% B i le 11 minute. A maeʻa le 8 minute i le 100%, toe faʻapaleni le koluma i le 5% B mo le 4 minute. O le fua faatatau o le tafe o le 0.3 ml min-1. O le ionization i le puna MS e faʻataunuʻuina e ala i le faʻavevela o le electrospray i le lelei ma le leaga.
O le mass spectrometer e fuaina faʻamaumauga i le m/z range mai le 350 i le 680 i le 60,000 resolution i le full MS mode. Na maua faʻamaumauga MS/MS i luga o le [M + H]+ (uma sini), [M - H2O + H]+ (uma sini), ma le [M - H]- (phosphorylated targets). Na faʻaaogaina faʻamaumauga MS/MS e faʻamaonia ai meatotino ecdysone o sini e leai se tulaga faʻatonuina na maua. Ina ia faʻailoa ecdysteroids e le o faʻamoemoeina, na suʻesuʻeina faʻamaumauga MS/MS mo tumutumuga uma o le HPLC ma le >15% o le tele o mea na tutupu. Fuafua e faʻaaoga ai piʻo faʻatonuina na faia mai tulaga mama (20E, 3D20E) e fuafua ai aofaʻiga moni poʻo faʻaitiitia o le tasi faʻataʻitaʻiga faʻapitoa (uma isi sini) e fuafua ai lo latou tutusa ma aofaʻiga na maua i le tasi tane. Mo le 3D20E, na faia le fuaina e faʻaaoga ai le aofaʻi o mea nei: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Sa aveeseina ma fuaina faʻamaumauga e faʻaaoga ai le Tracefinder (lomiga 4.1). Sa auiliiliina faʻamaumauga MS/MS e faʻaaoga ai le Xcalibur (lomiga 4.4). Sa faʻatusatusaina le MS spectra o le E, 20E ma le 3D20E i tulaga faʻatonuina taʻitasi. Sa auiliiliina le 3D20E22P e ala i le derivatization ma le Girard's reagent. Sa auiliiliina le 20E22P e ala i le m/z ratio.
Sa fa'amamāina le 3D20E22P mai le MAG. Sa fa'atinoina le fa'amamāina i luga o se fua fa'atatau fa'ata'ita'i e fa'aaoga ai se ultra-performance liquid chromatograph (Acquity, Waters) fa'atasi ai ma se quadrupole mass-based detector (QDa, Acquity, Waters) i lalo o tulaga tutusa o le LC e pei o le HPLC-MS/MS analysis. Sa fa'agaoioia le aoina o vaega ina ua iloa le m/z e fetaui ma le 3D20E22P i le taimi tutusa e taofia ai e pei ona fuafuaina muamua. Ona siakiina lea o le mama o vaega na fa'a'esea e ala i le HPLC-MS/MS e pei ona fa'amatalaina i luga.
Sa aveeseina le RNA atoa mai le 10-12 aano o le tino e toe fanau ai pe isi vaega o le tino (e leai se ulu) e faʻaaoga ai le TRI reagent (Thermo Fisher) e mulimuli i faʻatonuga a le kamupani gaosi. Sa togafitia le RNA i le TURBO DNase (Thermo Fisher). Sa faʻapipiʻiina le cDNA e faʻaaoga ai le Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) e mulimuli i faʻatonuga a le kamupani gaosi. Sa lolomiina muamua Primers mo le reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2)24 pe mamanuina e faʻaaoga ai le Primer-BLAST26, ma le faʻamuamua i oloa e 70-150 bp le lapoʻa ma aofia ai exon-exon junctions poʻo Primer pair primers exons eseese. O faʻataʻitaʻiga cDNA mai le tolu i le fa biological replicates sa faʻavaivaia fa i le vai mo le RT-qPCR. Sa faia le faʻatusatusaga i le 15 µl replicate reaction o loʻo i ai le 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers, ma le 5 µl o le diluted cDNA. Sa faʻatinoina tali i luga o le QuantStudio 6 Pro. Sa aoina ma au'ili'iliina le faiga o le PCR i le taimi moni (Thermo Fisher) ma fa'amaumauga e fa'aaoga ai le Design and Analysis (lomiga 2.4.3). E pei ona fa'aalia i lenei su'esu'ega, o aofa'iga fa'atatau sa fa'atulagaina i le ribosomal gene RpL19 (AGAP004422), o lona fa'aaliga e le'i suia tele i le fafagaina o le toto 27 po'o le fa'aipoipoga 3.
Sa siakiina le lelei o le RNA e faʻaaoga ai le Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Sa saunia ma faʻatautaia faletusi Illumina paired-end i le Broad Institute o MIT ma Harvard. Sa faʻatulagaina faitauga o le faʻasologa i le genome o le A. gambiae (PEST strain, version 4.12) e faʻaaoga ai le HISAT2 (version 2.0.5) faʻatasi ai ma faʻamaumauga masani. Sa aveeseina faitauga ma le tulaga lelei o le faʻafanua (MAPQ) togi <30 e faʻaaoga ai le Samtools (version 1.3.1). Sa faitauina le aofaʻi o faitauga ua faʻafanua i genes e faʻaaoga ai le htseq-count (version 0.9.1) faʻatasi ai ma faʻamaumauga masani. Sa fuafuaina le aofaʻi o faitauga masani ma suʻesuʻeina le faʻaalia o genes eseese e faʻaaoga ai le afifi DESeq2 (version 1.28.1) i le R (version 4.0.3).
Sa fa'ailoaina sui o kene e suia le Ecdysone e ala i le su'esu'eina muamua o le genome o le A. gambiae e fa'aaoga ai le algorithm PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), e fa'aaoga ai tau masani o Parameters ma fa'asologa o polotini nei: mai le Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 ma le XP_011294434.1) ma le Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 ma le XP_008552645.1) EcK mai le B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), Apis mellifera (No. Fa'aopoopoga XP_394838) ma le Acyrthosiphon pisum (No. Fa'aopoopoga XP_001947166); ma le EPP mai le B. mori (No. Fa'aopoopoga XP_001947166) NP_001177919.1 ma le NP_001243996.1) ma le EO o le D. melanogaster (No. Fa'aopoopoga NP_572986.1) (la'asaga 1). Sosoo ai, fa'amama ia fa'amaumauga e fa'atatau i le maualuga o le fa'aalia o le mRNA (>100 fragments/kilobase exons i le miliona o faitauga ua fa'afanua (FPKM) po'o le >85%) i totonu o le a'ano fanautama (LRT fafine po'o le MAG) i Gambia (la'asaga 2). Mo le fa'aleleia atili o le fa'apitoa, na matou filifilia ni enzymes sui tauva o lo'o fa'aalia fo'i i totonu o le a'ano toe fanau o le A. albimanus, o se ituaiga anopheles e le fa'aputuina pe fa'aliliuina le ecdysone i le taimi o le fa'aipoipoga. O genes sui tauva na fa'amamāina e fa'atatau i le maualalo o le fa'aaliga (<100 FPKM po'o le <85th percentile) i totonu o le a'ano toe fanau o le A. albimanus (la'asaga 3). I le avea ai ma se faamama mulimuli (la'asaga 4), e mana'omia e genes sui tauva ona fa'amalieina le itiiti ifo ma le tasi o mea nei: (1) fa'ateleina tele pe a uma le fa'aipoipoga (P < 0.05) e tusa ai ma le au'ili'iliga o genes eseese o lo'o fa'aalia ma le (2) i totonu o a'ano e le toe fanau (< 85% po'o le <100 FPKM).
Na matou suia auala na faʻamatalaina muamua 28,29,30 ina ia maua ai le faʻailogaina o isotopic o meaola uma. I se aotelega, o le ituaiga vao o le Saccharomyces cerevisiae ituaiga II (YSC2, Sigma) na faʻataʻitaʻiina i le yeast nitrogen base (BD Difco, DF0335) o loʻo i ai le (wt/vol) 2% glucose (G7528, Sigma), 1.7% amino acid-free ma le ammonium sulfate. culture medium) ma le 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) o le puna autu lea o le nitrogen. Na toe maua le yeast e ala i le centrifugation ma na fafagaina anufe o le namu i le taimi e mafai ai seʻia oʻo ina pupation. Faʻaopoopo i le fishmeal (0.5 mg i le 300 anufe) e puipuia ai le oti i le instar lona fa. Naʻo fafine na faʻaaogaina i faʻataʻitaʻiga faʻafeusuaiga ma tane e leʻi faʻailogaina e iloilo ai le proteome tane na faʻaliliuina i le taimi o le faʻafeusuaiga.
O tama'ita'i taupou e 4-6 aso le matutua ma e 15N-tags na fa'amalosia e fa'aipoipo ma tama'ita'i taupou e le'i fa'ailogaina e tutusa o latou tausaga. Na fa'amaonia le manuia o le fa'aipoipo e ala i le iloa o plugs fa'aipoipo i lalo o le microscopy epifluorescence. I le 3, 12, ma le 24 hpm, o le atria o tama'ita'i e 45-55 na fa'aipoipo na vaevaeina i totonu o le 50 µl o le ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) ma fa'afefiloi i se pestle. Na centrifuged le homogenate ma fa'afefiloi le supernatant ma le 50 µl o le 0.1% RapiGest (186001860, Waters) i le 50 mM ammonium bicarbonate. O le supernatant ma le pellet mai fa'ata'ita'iga ta'itasi na fa'a'aisa i luga o le aisa mago ma lafo i le po i le fale su'esu'e MacCoss i le Iunivesite o Uosigitone, lea na mae'a ai le sauniuniga o fa'ata'ita'iga mo le LC-MS/MS. Toe fa'asusu le pellet i le 50 µl o le 0.1% RapiGest i le 50 mM ammonium bicarbonate ma sonicate i totonu o se vai taele. O le maualuga o le porotini o le pellet ma le supernatant na fuaina e ala i le BCA assay, na faʻaitiitia faʻataʻitaʻiga i le 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylated ma le 15 mM iodoacetamide (Sigma) ma faʻasusu i le 37 °C (1:0 50) mo le 1 itula ma le trypsinization: trypsin:substrate ratio). Na lysed RapiGest e ala i le faʻaopoopoina o le 200 mM HCl, sosoo ai ma le faʻasusu i le 37 °C mo le 45 minute ma le centrifugation i le 14,000 rpm mo le 10 minute i le 4 °C e aveese ai otaota. Na fufuluina faʻataʻitaʻiga e ala i le dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) ma toe faʻasusu i le 0.1% formic acid mo se faʻaputuga porotini mulimuli o le 0.33 µg µl-1. O proteomes MAG e leʻi faʻailogaina na faʻapena foʻi ona suʻesuʻeina mai tama taupou. E lua faʻataʻitaʻiga suʻesuʻe na suʻesuʻeina mo taʻitasi. faʻataʻitaʻiga. Sosoo ai, na suʻesuʻeina le 1 µg o mea taʻitasi e faʻaaoga ai le koluma 25-cm fused silica 75-μm faʻatasi ai ma le 4-cm fused silica Kasil1 (PQ) frit trap ua faʻatumuina i le Jupiter C12 reversed-phase resin (Phenomenex) ma le 180-minute liquid chromatography. Fa'ata'ita'iga o fa'amatalaga - Sa fa'atinoina le MS/MS i luga o le Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) fa'atasi ai ma le nanoACQUITY UPLC System (Waters). O fa'amaumauga e feso'ota'i ma fa'amaumauga na gaosia mo fa'agasologa ta'itasi na liua i le fa'atulagaga mzML e fa'aaoga ai le Proteowizard (lomiga 3.0.20287) ma le fa'aaogaina o le Comet31 (lomiga 3.2) e fa'asaga i le fa'amaumauga FASTA o lo'o i ai fa'asologa o porotini mai le Anopheles gambiae (VectorBase lomiga 54), Anopheles coluzzi Sa faia se sailiga i le Mali-NIH (VectorBase lomiga 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mati 2021), A. gambiae RNA-seq, ma fa'aliliuga e tolu-fa'avaa o mea leaga ua iloa e tagata. O FDRs e fetaui ma le fa'afanua o peptide na fuafuaina e fa'aaoga ai le Percolator32 (lomiga 3.05) fa'atasi ai ma se tulaga fa'atapula'a o le 0.01, ma peptides na tu'ufa'atasia i totonu o fa'ailoga o porotini e fa'aaoga ai le parsimony o porotini i le Limelight33 (lomiga 2.2.0). Sa fuafuaina le tele o porotini fa'atatau e fa'aaoga ai le normalized spectral abundance factor (NSAF) na fuafuaina mo porotini ta'itasi i ta'amilosaga ta'itasi e pei ona fa'amatalaina muamua. O le NSAF e fa'atatau i porotini ta'itasi na fa'atatauina i fa'ata'ita'iga mai ni fa'ata'ita'iga fa'aola eseese se lua. O le fa'ailogaina o le 15N na fa'amanuiaina ai le ufiufiina o le proteome fafine, e ui lava na mafai ona iloa se vaega itiiti o porotini e le'i fa'ailogaina mai taupou ua fa'ailogaina. Na matou fa'amaumauina le iloa o le fa'aitiitia o porotini tane (1-5 spectra) i fa'ata'ita'iga mata fafine na'o ta'amilosaga fa'atekinolosi, lea na fa'atautaia ai fa'ata'ita'iga mata pe a uma fa'ata'ita'iga tane/fa'aipoipoga, o se taunuuga o le "tauaveina" o le HPLC. O nisi taimi o porotini na maua o ni 'mea leaga' mai taupou ua fa'ailogaina o lo'o lisiina i le Fa'aopoopoga Laulau 1.
E lua peptides antigenic, QTTDRVAPAPDQQQ (i totonu o le isotype PA) ma le MESDGTTPSGDSEQ (i totonu o le isotype PA ma le PB) i le Genscript. Sa tuufaatasia peptides e lua, ona faapipii lea i le porotini feaveai KLH ma tui i lapiti Niu Sila. Sa fasiotia lapiti ina ua maeʻa le tui lona fa, ma sa vavaeeseina le IgG atoa e ala i le affinity purification. Sa faaaogaina le IgG mai le lapiti e sili ona faapitoa i le EPP mo nisi western blotting.
Mo western blots, o le MAG (n = 10, lea o le n o loʻo faʻatusalia ai le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga o namu tutoʻatasi faʻaolaola) ma le fafine LRT (n = 30) mai tane taupou e 4-aso le matutua ma fafine taupou poʻo fafine na faʻamalosia le faʻaipoipo (<10 post-mating), o le Protein extraction buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) na faʻaopoopoina eseese. O faʻataʻitaʻiga na faʻafefiloi i le taimi lava na maeʻa ai le dissection i se beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 sec). O otaota e le mafai ona soloia na aveese e ala i le centrifugation i le 20,000 g i le 4 °C. O porotini na fuaina e ala i le Bradford assay (Bio-Rad). Ona, 20 µg o le porotini MAG, 40 µg o le porotini LRT, ma le 20 µg o le porotini tele na totoe na faʻaaogaina. na fa'aleagaina ma vavae'eseina e le 10% Bis-Tris NuPAGE e fa'aaoga ai le MOPS buffer. Na fa'aliliuina porotini i totonu o membrane polyvinylidene fluoride e fa'aaoga ai le iBlot2 transfer system (Thermo Fisher). Na fufuluina fa'alua membrane i le 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 i le PBS) ona poloka lea i le Odyssey blocking buffer (Li-Cor) mo le 1 itula i le 22°C. Na luluina membrane i le po atoa i le 4°C ma le custom rabbit anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 i le blocking buffer) ma le rat anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000). Na fufuluina membrane i le PBS-T ona fa'afefiloi lea ma antibodies lona lua (asini anti-rabbit 800CW ma le goat anti-rat 680LT (Li-Cor), e lua 1:20,000) i le blocking buffer o lo'o i ai le 0.01% SDS ma le 0.2% Tween -20 mo le 1 itula i le 22 °C. Sa fufuluina membrane i le PBS-T ma pu'eina ata i se scanner Odyssey CLx. Sa aoina ma fa'agasoloina ata i le Image Studio (lomiga 5.2). E le'i iloa se fusi fa'apitoa e fetaui ma le EPP-RA isoform (82 kDa).
O vaega fa'ailoga o le EPP (e pei o le isoform AGAP002463-RB o lo'o i ai le histidine phosphatase domain, NCBI conserved domain search 34) ma le EcK2 (AGAP002181) na fa'apipi'iina i totonu o le pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); O lo'o lisiina atu primers i le Extended Data Table 2. E valu GS4 linkers (fa'atasi) na fa'aofiina a'o le'i o'o i le C-terminal 6xHis tag o le pET-21a(+)-EcK2 construct. Na gaosia porotini recombinant e fa'aaoga ai le NEBExpress cell-free E. coli protein synthesis reaction (New England BioLabs). Na fa'amamāina porotini recombinant e fa'aaoga ai NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs). Na gaosia le porotini pulea Dihydrofolate reductase (DHFR) e fa'aaoga ai le DNA template mai le NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Na teuina porotini i le 50% glycerol i le PBS ile -20 °C mo le 3 masina.
Sa fuaina le gaioiga o le phosphatase o le EPP ma mea e maua mai i le tino e faʻaaoga ai le 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). O le reaction buffer sa iai le 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ma le 1 mM DTT. Sa faʻafefiloi le tino i totonu o le reaction buffer ma aveese otaota o le sela e ala i le centrifugation. Amata le reaction e ala i le faʻaopoopoina o le enzyme poʻo le mea e maua mai i le tino i le reaction buffer o loʻo iai le 2.5 mg ml-1 pNPP. Sa faʻasusu le paluga reaction i le vevela o le potu i le pogisa, ma o le aofaʻi o le pNP na liua mai le pNPP sa fuaina e ala i le fuaina o le absorbance i le 405 nm i taimi eseese.
Mo le gaioiga in vitro EcK, na fa'afefiloi le porotini ma le 0.2 mg 20E po'o le 3D20E i totonu o le 200 µl buffer (pH 7.5) o lo'o i ai le 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ma le 10 mM MgCl2 mo le 2 itula i le 27 °C. Na taofia le tali atu i le fa'aopoopoina o le 800 µl methanol, ona fa'amālūlūina lea i le -20 °C mo le 1 itula, ona fa'acentrifuge lea i le 20,000 g mo le 10 minute i le 4 °C. Ona su'esu'eina lea o le supernatant e ala i le HPLC-MS/MS. Ina ia fa'avevela-fa'agata porotini na fa'aaogaina i le vaega pulea, na fa'afefiloi porotini i le 50% glycerol i le PBS mo le 20 minute i le 95 °C.
Mo le gaioiga a le EPP i totonu o le vitro, na fa'afefiloi le porotini ma le 3D20E22P (tutusa ma le aofa'i na maua i le 18 paga o le MAG, na fa'amamāina e le HPLC-MS/MS) i le 100 µl buffer (pH 7.5) o lo'o i ai le 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ma le 1 mM DTT mo le 3 itula i le 27 °C. Na taofia le tali atu i le fa'aopoopoina o le 400 µl methanol ma fa'amālūlūina i le -20 °C mo le 1 itula, ona fa'acentrifuge lea i le 20,000 g mo le 10 minute i le 4 °C. Na au'ili'iliina le supernatant e le HPLC-MS/MS.
O vaega PCR mo le EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ma le EcK2 (556 bp) na fa'ateleina mai le cDNA na saunia mai tino maliu o namu e leai ni ulu mai itupa eseese. O le vaega PCR o le pulega eGFP (495 bp) na fa'ateleina mai le pCR2.1-eGFP na fa'amatalaina muamua; O lo'o lisiina atu PCR primers i le Extended Data Table 2. O le fasi PCR na fa'aofiina i le va o inverted T7 promoters i luga o le pL4440 plasmid. O plasmid constructs na toe maua mai le NEB 5-α competent E. coli (New England Biolabs) ma fa'amaonia e ala i le DNA sequencing a'o le'i fa'aaogaina (tagai i le Supplementary Data 1 mo le fa'asologa o mea na fa'aofi). O Primers na fetaui ma le T7 promoter (Extended Data Table 2) na fa'aaogaina e fa'ateleina ai le mea na fa'aofi mai le pL4440-based plasmid. O le tele o le oloa PCR na fa'amaonia e ala i le agarose gel electrophoresis. O le dsRNA na fa'aliliuina mai PCR templates e fa'aaoga ai le Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ma fa'amamāina e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa fa'atasi ai ma suiga na fa'amatalaina muamua.
Mo le tuiina o le dsRNA, na tuiina le 1,380 ng o le dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) i le maualuga o le 10 ng nl-1 i totonu o le fatafata o tane matutua po o fafine (Nanoject III, Drummond) i totonu o le aso e 1 talu ona maeʻa le eclosion. O le maualuga o le faʻaitiitia o kene na fuafuaina i le itiiti ifo ma le tolu faʻataʻitaʻiga faʻapitoa e ala i le faʻamamāina o le RNA, faʻasologa o le cDNA, ma le RT-qPCR. Mo le tuiina o le ecdysone, o fafine taupou e 4-aso le matutua poʻo fafine taupou e 6-aso le matutua na fafagaina i le toto na tuiina i le 0.13, 0.21, poʻo le 0.63 µg o le 20E poʻo le 3D20E (Nanoject III, Drummond) i le maualuga o le 1.3, 2.1, i le faasologa, e fuafua i le mamanu faʻataʻitaʻi poʻo le 6.3 ng nl-1. Tuiina le 100 nl o le 10% (vol/vol) ethanol i le vai; 100 nl o le 3D20E22P i le 10% ethanol (tutusa ma le 75% o le aofaʻi o loʻo maua i se paga o MAGs). Sa vaevaeina faafuaseʻi namu i le vaega na tuiina.
Mo su'ega o le fanautama, o namu fafine e 3 aso le matutua sa fafagaina i le toto o le tagata i se auala e aunoa ma se fesoasoani. Aveese namu na fafagaina fa'atasi pe le'i fafagaina. Fa'alagolago i le togafitiga, na tu'u namu fafine i totonu o ipu fanautama eseese mo po e fa e le itiiti ifo i le 48 itula talu ona uma ona 'ai le toto. Sa faitauina fuamoa i lalo o se stereoscope (Stemi 508, Zeiss); mo fafine ua fa'aipoipo, o fuamoa na fofoa e avea ma anufe sa manatu e fanautama.
Mo tofotofoga fa'afeusuaiga, na fa'atagaina fafine mo le itiiti ifo i le 2 aso e fa'atatau i le togafitiga e atia'e ai le tete'e i le fa'afeusuaiga, ma o tane e tutusa tausaga ma ituaiga vao na fa'aofiina mulimuli ane i totonu o le pa lava e tasi. I po e lua mulimuli ane, na vaevaeina ai vesicles fafine na fa'afefeteina ma fa'asa'olotoina le DNA genomic e ala i le fa'a'aisa-fa'asusu ma le sonication i totonu o se buffer o lo'o i ai le 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, ma le 25 mM NaCl (pH 8.2). Na fa'afefiloi fa'ata'ita'iga i le Proteinase K (0.86 µg µl-1) mo le 15 minute i le 55 °C, sosoo ai ma le 10 minute i le 95 °C. O sauniuniga DNA genomic mata na fa'avaivaia 10-fold ma faia i le qPCR e iloa ai fa'asologa o chromosome Y; o primers o lo'o lisiina i le Extended Data Table 2. O le leai o se fa'asologa o chromosome Y e fa'aalia ai le leai o se fa'afeusuaiga.
Mo suʻega toe faʻafeusuaiga, na suʻesuʻeina fafine na faʻamalosia le faʻafeusuaiga mo le i ai o plugs faʻafeusuaiga e faʻamaonia ai le tulaga faʻafeusuaiga ma faʻatagaina aso e 2 e atiaʻe ai le teteʻe i le faʻafeusuaiga pe a leai ni tane, e pei ona faʻamatalaina muamua 36. Ona faʻaofiina lea o tane o loʻo tauaveina le sperm transgenic DsRed i totonu o pa fafine. I po e lua mulimuli ane, na vavaeʻeseina ai vesicles faʻapalaga mai fafine, ma saunia le DNA genomic e pei ona faʻamatalaina i luga ma faia i le qPCR le iloa o le DsRed transgene; o loʻo lisiina primers i le Extended Data Table 2. O le leai o le DsRed transgene na faʻaalia ai e leai se toe faʻafeusuaiga na tupu.
Sa fa'aputuina le 3D20E e pei ona fa'amatalaina muamua 37. I se fa'apu'upu'u, 10 mg o le 20E (Sigma-Aldrich) sa fa'a'asu'u i le 10 ml o le vai, sosoo ai ma le fa'aopoopoina o le 30 mg o le platinum black (i le foliga o le pauta, Sigma-Aldrich). O se vaitafe filemu o le O2 sa fa'aauau pea ona fa'apuna i totonu o le paluga o le tali, lea na fa'a'asu'u i le vevela o le potu. Ina ua mavae le 6 itula, sa fa'aopoopoina le 30 mL o le methanol e taofi ai le tali. Sa fa'a'au'au le paluga e aveese ai vaega o le catalyst. Sa fa'amamago le supernatant se'ia mago i totonu o le vacuum i le vevela o le potu. O le oloa tali mago sa fa'a'asu'u i le 10% ethanol ma le methanol mo le tui mo le su'esu'ega HPLC-MS/MS. O le fua faatatau o le liua (mai le 20E i le 3D20E) e tusa ma le 97% (Ata 4b), ma o le MS spectrum o le 3D20E na fa'aputuina e fetaui ma mea na maua i fafine ua fa'aipoipo (Ata 4c).
O le fa'amatalaga o lo'o i ai fa'amatalaga patino o su'ega fa'amaumauga na faia. Na fa'aaogaina le GraphPad (lomiga 9.0) e fa'atino ai le su'ega sa'o a Fisher, le su'ega Mantel-Cox, ma le su'ega t a Student. Na fa'atinoina su'ega Cochran-Mantel-Haenszel e fa'aaoga ai se tusitusiga R fa'apitoa (o lo'o maua ile https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Na fa'ata'ita'iina le tufatufaina o fa'amaumauga mo le tulaga masani e fa'aaoga ai le su'ega Shapiro-Wilk ma se tapula'a taua o le 0.05. Ina ua le manuia fa'amaumauga i le su'ega masani, na fa'atinoina ai le su'ega Mann-Whitney. Na au'ili'iliina fa'amaumauga o le ola e fa'aaoga ai le su'ega Mantel-Cox. Na fa'aaogaina le afifi DESeq2 (lomiga 1.28.1) e fa'atino ai le au'ili'iliga o le fa'aalia o le eseesega o le tulaga o le kenera RNA-seq. O le pa fa'alava i luga o le kalafi o lo'o fa'atusalia ai le ogatotonu. O le taua o le P = 0.05 na fa'aaoga e fai ma tapula'a mo su'ega uma.
Mo nisi faʻamatalaga e uiga i le mamanu o le suʻesuʻega, tagaʻi i le aotelega o le Nature Research Report o loʻo fesoʻotaʻi ma lenei tusiga.
O faʻamaumauga proteomic MS na teuina i totonu o le ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) e ala i le PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) faʻatasi ai ma le faʻailoga o le seti o faʻamaumauga PXD032157.
O le fa'amaumauga o le RNA-seq ua teuina i le Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) i lalo o le fa'amaumauga fa'asolosolo GSE198665.
E mafai ona maua mai tusitala fa'aopoopo o lo'o gaosia ma/pe iloiloina i le taimi o le su'esu'ega o lo'o faia nei pe a mana'omia se talosaga talafeagai. O lenei tusiga o lo'o tu'uina atu ai fa'amatalaga autu.
De Loof, A. Ecdysteroids: O steroids feusuaiga a iniseti ua le amana'iaina? Tane: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone ma le atina'eina o le ovarian i le Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).