O metabolites immunomodulatory o se vaega autū o le siosiomaga o le tumo (TME), ae vagana ai ni nai tuusaunoaga, e le o iloa tele o latou faasinomaga. Iinei, na matou iloiloina ai tumo ma sela T mai tumo ma ascites o gasegase e maua i le carcinoma serous maualuga (HGSC) e faʻaalia ai le metabolome o nei vaega eseese o le TME. E tele eseesega o metabolites o ascites ma sela tumo. Pe a faʻatusatusa i ascites, o sela T e ulufale i le tumo e matua faʻamauoa lava i le 1-methylnicotinamide (MNA). E ui o le maualuga o le MNA i sela T e maualuga, o le faʻaalia o le nicotinamide N-methyltransferase (o se enzyme e faʻagaoioia ai le fesiitaiga o vaega methyl mai le S-adenosylmethionine i le nicotinamide) e faʻatapulaʻaina i fibroblasts ma sela tumo. I le faʻatinoga, e faʻaosofia e le MNA sela T e faʻasaʻoloto le cytokine tumor necrosis factor alpha e faʻalauiloa ai le tumo. O le mea lea, o le MNA e maua mai i le TME e fesoasoani i le faʻatonutonuina o le puipuiga o sela T ma o loʻo faʻatusalia ai se sini faʻapitoa mo le immunotherapy mo le togafitia o le kanesa o le tagata.
E mafai e metabolites e maua mai i le tumo ona i ai se aafiaga tele i le puipuiga o le tino mai le tumo, ma o loʻo faʻateleina pea faʻamaoniga e faʻaalia ai e mafai foi ona avea o se malosiaga autu mo le alualu i luma o faʻamaʻi (1). I le faʻaopoopoga i le aafiaga o Warburg, ua amata ona faʻamatalaina e galuega talu ai nei le tulaga o le metabolism o sela o le tumo ma lona sootaga ma le tulaga o le puipuiga o le siosiomaga o le tumo (TME). O suʻesuʻega i luga o faʻataʻitaʻiga o isumu ma sela T o le tagata ua faʻaalia ai e mafai e le metabolism o le glutamine (2), metabolism oxidative (3) ma le metabolism o le glucose (4) ona galue tutoʻatasi i luga o vaega eseese o sela puipuia. O le tele o metabolites i nei auala e taofia ai le galuega faʻasaga i le tumo o sela T. Ua faʻamaonia o le poloka o le coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) e mafai ona faʻaleagaina ai le faʻateleina o sela T, ma o le faʻateleina o le BH4 i le tino e mafai ona faʻaleleia atili ai le tali atu o le puipuiga o le tino mai le tumo e mafua mai i le CD4 ma le CD8. I se faʻaopoopoga, o le aafiaga o le puipuiga o le tino o le kynurenine e mafai ona laveaʻiina e ala i le tuʻuina atu o le BH4 (5). I le isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma, o le fa'asa'olotoina o le enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) e taofia ai le fa'agaoioiga o le sela T, le fa'ateleina ma le gaioiga o le cytolysis (6). Talu ai nei, ua fa'aalia ai o le methylglyoxal, o se oloa e maua mai i le glycolysis, e gaosia e sela suppressor o le myeloid origin, ma o le fesiitaiga o le methylglyoxal i le sela T e mafai ona taofia ai le galuega a le effector T cell. I togafitiga, o le neutralization o le methylglyoxal e mafai ona faatoilaloina le gaioiga o sela suppressor myeloid (MDSC) ma fa'amalosia fa'atasi le togafitiga o le checkpoint blockade i fa'ata'ita'iga isumu (7). O nei su'esu'ega e fa'amamafa fa'atasi ai le matafaioi autu o metabolites e maua mai i le TME i le fa'atonutonuina o le galuega ma gaioiga a le sela T.
Ua lipotia lautele le le atoatoa o le galuega a le T cell i le kanesa o le ovarian (8). O se vaega lea ona o uiga o le metabolism e mafua mai i le hypoxia ma le abnormal tumor vasculature (9), lea e mafua ai ona liua le glucose ma le tryptophan i ni oloa e pei o le lactic acid ma le kynurenine. O le tele o le extracellular lactate e faʻaitiitia ai le gaosiga o le interferon-γ (IFN-γ) ma faʻatautaia ai le eseesega o vaega laiti o le myelosuppressive (10, 11). O le taumafaina o le tryptophan e taofia saʻo ai le tuputupu aʻe o le T cell ma taofia ai le faʻailoilo a le T cell receptor (12-14). E ui i nei matauga, o le tele o galuega e siomia ai le metabolism o le puipuiga o le tino na faia i totonu o le in vitro T cell culture e faʻaaoga ai ala o faasalalauga ua faʻaleleia atili, pe faʻatapulaʻaina i faʻataʻitaʻiga o isumu tutusa i totonu o le vivo, e leai se tasi o nei mea e atagia atoatoa ai le heterogeneity o kanesa o tagata ma le Physiological macro ma micro environment.
O se uiga masani o le kanesa o le ovarian o le sosolo o le peritoneal ma le aliali mai o ascites. O le faaputuputuina o le vai o le sela i totonu o ascites e fesootai ma le alualu i luma o le faamai ma le leaga o le prognosis (15). E tusa ai ma lipoti, o lenei vaega tulaga ese e hypoxia, e maualuga le maualuga o le vascular endothelial growth factor (VEGF) ma le indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), ma e ulufia e sela T regulatory ma sela myeloid inhibitory (15-18). O le siosiomaga metabolic o ascites atonu e ese mai le tumo lava ia, o lea e le o manino ai le toe polokalameina o sela T i le peritoneal space. E le gata i lea, o eseesega autu ma le eseesega i le va o ascites ma metabolites o loʻo i totonu o le siosiomaga o le tumo atonu e taofia ai le ulufia o sela puipuia ma a latou galuega i luga o tumo, ma e manaʻomia nisi suʻesuʻega.
Ina ia foia nei faafitauli, na matou mamanuina se metotia o le vavaeesega o sela ma le liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) e suʻesuʻe ai ituaiga eseese o sela (e aofia ai sela CD4 + ma CD8 + T) faapea foi i totonu ma le va o tumo. O ana metabolites e aofia ai sela i le ascites tutusa ma le siosiomaga o le tumo o le maʻi. Matou te faʻaaogaina lenei metotia faʻatasi ma le high-dimensional flow cytometry ma le single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) e tuʻuina atu ai se ata manino o le tulaga o le metabolism o nei vaega autu. O lenei metotia na faʻaalia ai se faʻaopoopoga tele i le tulaga o le 1-methylnicotinamide (MNA) i sela T o le tumo, ma o suʻega in vitro na faʻaalia ai o le aafiaga o le immunomodulatory o le MNA i le galuega a le sela T sa leʻi iloa muamua. I se tulaga lautele, o lenei metotia e faʻaalia ai fegalegaleaiga fefaʻasoaaʻi o le metabolism i le va o tumo ma sela puipuia, ma maua ai ni malamalamaga tulaga ese i metabolites o le puipuiga o le tino, lea e ono aoga mo le togafitia o le kanesa o le ovarian e faʻavae i luga o le sela T. Avanoa mo togafitiga immunotherapy.
Na matou faʻaaogaina le high-dimensional flow cytometry e faʻatatauina ai le faʻaaogaina o le kulukose [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ma le gaioiga o le mitochondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) o ni faʻailoga masani ia e iloa ai sela puipuia ma le faitau aofaʻi o sela o le tumo (Table S2 ma le Ata S1A). O lenei auʻiliʻiliga na faʻaalia ai pe a faʻatusatusa i sela T, o ascites ma sela o le tumo e maualuga atu le maualuga o le faʻaaogaina o le kulukose, ae e laʻititi ni eseesega i gaioiga o le mitochondrial. O le averesi o le faʻaaogaina o le kulukose o sela o le tumo [CD45-EpCAM (EpCAM)+] e tolu i le fa taimi nai lo sela T, ma o le averesi o le faʻaaogaina o le kulukose o sela CD4 + T e 1.2 taimi nai lo sela CD8 + T, lea e faʻaalia ai o lymphocytes o loʻo ulufale mai i le Tumo (TIL) e eseese manaʻoga faʻale-metabolism e tusa lava pe i le TME lava e tasi (Ata 1A). I se faatusatusaga, o le gaioiga o le mitochondrial i totonu o sela o le tumo e tutusa ma sela CD4 + T, ma o le gaioiga o le mitochondrial o ituaiga sela uma e lua e maualuga atu nai lo sela CD8 + T (Ata 1B). I se tulaga lautele, o nei taunuuga e faaalia ai le tulaga o le metabolism. O le gaioiga o le metabolism o sela o le tumo e maualuga atu nai lo sela CD4 + T, ma o le gaioiga o le metabolism o sela CD4 + T e maualuga atu nai lo sela CD8 + T. E ui i nei aafiaga i ituaiga sela, e leai se eseesega tumau i le tulaga o le metabolism o sela CD4 + ma CD8 + T po o latou fua faatatau i ascites pe a faatusatusa i tumo (Ata 1C). I se faatusatusaga, i le vaega o sela CD45, o le fua faatatau o sela EpCAM+ i le tumo na faateleina pe a faatusatusa i ascites (Ata 1D). Na matou matauina foi se eseesega manino o le metabolism i le va o vaega o sela EpCAM+ ma EpCAM-. O sela EpCAM+ (tumo) e sili atu le maualuga o le glucose uptake ma le gaioiga o le mitochondrial nai lo sela EpCAM-, lea e sili atu le maualuga nai lo le gaioiga o le metabolism o fibroblasts i sela o le tumo i le TME (Ata 1, E ma le F).
(A ma le B) Malosiaga o le fluorescence ogatotonu (MFI) o le fa'aaogaina o le kulukose (2-NBDG) (A) ma le gaioiga mitochondrial o sela CD4 + T (MitoTracker mumu pogisa) (B) Kalafi fa'atusa (agavale) ma fa'amaumauga fa'amaufa'ailoga (Taumatau), sela CD8 + T ma sela EpCAM + CD45-tumor mai ascites ma le tumo. (C) O le fua fa'atatau o sela CD4 + ma le CD8 + (o sela CD3 + T) i ascites ma le tumo. (D) Fua fa'atatau o sela EpCAM + tumo i ascites ma le tumo (CD45−). (E ma le F) EpCAM + CD45-tumo ma le EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) ma le gaioiga mitochondrial (MitoTracker mumu pogisa) (F) kalafi fa'atusa (agavale) ma fa'amaumauga fa'amaufa'ailoga (Taumatau) Ascites ma sela tumo. (G) Kalafi fa'atusa o le fa'aalia o le CD25, CD137 ma le PD1 e ala i le flow cytometry. (H ma le I) Fa'aaliga o le CD25, CD137 ma le PD1 i luga o sela CD4 + T (H) ma sela CD8 + T (I). (J ma le K) Fa'ailoga o le manatua tutotonu (Tcm), effector (Teff) ma le manatua o le effector (Tem) e fa'avae i luga o le fa'aaliga o le CCR7 ma le CD45RO. Ata fa'atusa (agavale) ma fa'amaumauga fa'ata'ita'i (taumatau) o sela CD4 + T (J) ma sela CD8 + T (K) i ascites ma tumors. O tau P e fuafuaina e ala i le t-test fa'atasi (*P<0.05, **P<0.01 ma le ***P<0.001). O le laina e fa'atusalia ai gasegase tutusa (n = 6). FMO, fluorescence minus one; MFI, median fluorescence intensity.
O isi suʻesuʻega na faʻaalia ai isi eseesega taua i le va o le tulaga maualuga o le phenotypic o le T cell. O le activated (Ata 1, G i le I) ma le effector memory (Ata 1, J ma le K) i tumo e sili atu ona taatele nai lo le ascites (vaega o CD3 + T cells). I se tulaga tutusa, o le iloiloina o le phenotype e ala i le faʻaalia o activation markers (CD25 ma le CD137) ma le depletion markers [programmed cell death protein 1 (PD1)] na faʻaalia ai e ui lava e eseese uiga metabolic o nei faitau aofaʻi (Ata S1, B i le E), Ae leai ni eseesega taua o le metabolic na matauina pea i le va o naive, effector poʻo memory subsets (Ata S1, F i le I). O nei taunuuga na faʻamaonia e ala i le faʻaaogaina o metotia o le aʻoaʻoina o masini e otometi lava ona tofia ai phenotypes o le cell (21), lea na faʻaalia atili ai le i ai o le tele o sela o le ponaivi (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) i le ascites o le maʻi (Ata S2A). I totonu o ituaiga sela uma na fa'ailoaina, o lenei vaega o sela myeloid na fa'aalia ai le maualuga o le fa'aaogaina o le kulukose ma le gaioiga o le mitochondrial (Ata S2, B i le G). O nei taunuuga e fa'amamafaina ai eseesega tetele o le metabolism i le va o ituaiga sela eseese o lo'o maua i ascites ma tumors i gasegase HGSC.
O le luʻitau autū i le malamalama i uiga faʻale-metabonomi o le TIL o le manaʻomia lea ona vavaeʻese faʻataʻitaʻiga o sela T e lava le mama, lelei ma le tele mai tumo. O suʻesuʻega talu ai nei ua faʻaalia ai o metotia faʻavasega ma faʻamauoa o bead e faʻavae i luga o le flow cytometry e ono oʻo atu ai i suiga i faʻamatalaga o metabolite o le sela (22-24). Ina ia foʻia lenei faʻafitauli, na matou faʻaleleia atili le metotia faʻamauoa o bead e vavaeʻese ma vavaeʻese ai le TIL mai le kanesa o le ovarian o le tagata na tipiina i le taotoga aʻo leʻi faia le suʻesuʻega e le LC-MS/MS (tagai Meafaitino ma Metotia; Ata 2A). Ina ia iloilo le aʻafiaga lautele o lenei faʻatulagaga i suiga o metabolite, na matou faʻatusatusaina faʻamatalaga o metabolite o sela T na faʻagaoioia e tagata foaʻi maloloina ina ua maeʻa le laʻasaga o le vavaeʻeseina o bead i luga ma sela e leʻi vavaeʻese bead ae na tumau pea i luga o le aisa. O lenei suʻesuʻega o le pulea lelei na maua ai o loʻo i ai se fesoʻotaʻiga maualuga i le va o nei tulaga e lua (r = 0.77), ma o le toe fai faʻapitoa o le vaega o metabolites e 86 e maualuga le toe fai (Ata 2B). O le mea lea, o nei metotia e mafai ona faia ai se auʻiliʻiliga saʻo o metabolite i sela o loʻo faʻaleleia atili ai le ituaiga o sela, ma maua ai le uluai faʻavae maualuga mo le faʻailoaina o metabolites patino i le HGSC, ma mafai ai e tagata ona maua se malamalamaga loloto i le faʻapitoa o sela. Polokalame o le metabolism feusuaiga.
(A) Ata fa'ata'ita'i o le fa'amauoa o le magnetic bead. A'o le'i faia le su'esu'ega e ala i le LC-MS/MS, o le a faia e sela ni ta'amilosaga fa'asolosolo se tolu o le fa'amauoa o le magnetic bead pe tumau pea i luga o le aisa. (B) Le a'afiaga o le ituaiga fa'amauoa i le tele o metabolites. O le averesi o fua e tolu mo ituaiga fa'amauoa ta'itasi ± SE. O le laina efuefu o lo'o fa'atusalia ai se mafutaga 1:1. O le feso'ota'iga i totonu o le vasega (ICC) o fua fa'asolosolo o lo'o fa'aalia i le fa'ailoga axis. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Ata fa'ata'ita'i o le faiga o le su'esu'ega o le metabolite a le ma'i. O ascites po'o tumors e aoina mai ma'i ma fa'asaoina i le cryopreserve. O se vaega la'ititi o fa'ata'ita'iga ta'itasi na su'esu'eina e ala i le flow cytometry, a'o fa'ata'ita'iga o totoe na faia ni ta'amilosaga fa'ata'ita'i e tolu o le fa'amauoa mo sela CD4+, CD8+ ma CD45-. O nei vaega o sela na su'esu'eina e ala i le LC-MS/MS. (D) Fa'afanua vevela o le tele o metabolite fa'atulagaina. O le dendrogram o lo'o fa'atusalia ai le fa'aputuga a Ward o mamao Euclidean i le va o fa'ata'ita'iga. (E) Su'esu'ega o vaega autū (PCA) o le fa'afanua o le metabolite o fa'ata'ita'iga, o lo'o fa'aalia ai ni kopi se tolu o fa'ata'ita'iga ta'itasi, o fa'ata'ita'iga mai le ma'i lava e tasi e feso'ota'i i se laina. (F) O le PCA o le fa'asologa o le metabolite o le fa'ata'ita'iga e fa'atatau i le ma'i (e pei o le fa'aaogaina o le toe fa'aopoopoina fa'aitiitiga); o le ituaiga o fa'ata'ita'iga e fa'atapula'aina e le convex hull. PC1, vaega autū 1; PC2, vaega autū 2.
Sosoo ai, na matou faʻaaogaina lenei metotia faʻamauoa e iloilo ai metabolites e 99 i vaega o le CD4 +, CD8 + ma le CD45-cell i totonu o le ascites muamua ma tumors o le ono gasegase HGSC (Ata 2C, Ata S3A ma le Laulau S3 ma le S4). O le faitau aofaʻi o loʻo fiafia i ai e aofia ai le 2% i le 70% o le faʻataʻitaʻiga tele muamua o sela ola, ma o le fua faatatau o sela e matua eseese lava i le va o gasegase. A maeʻa ona vavaeʻeseina ni beads, o le vaega faʻamauoa o loʻo fiafia i ai (CD4+, CD8+ poʻo le CD45-) e aofia ai le sili atu i le 85% o sela ola uma i le faʻataʻitaʻiga i le averesi. O lenei metotia faʻamauoa e mafai ai ona matou iloilo vaega o sela mai le metabolism o aano o le tumo o le tagata, lea e le mafai ona fai mai faʻataʻitaʻiga tetele. I le faʻaaogaina o lenei protocol, na matou iloa ai o le l-kynurenine ma le adenosine, o nei metabolites e lua ua faʻailoaina lelei e taofia ai le puipuiga o le tino na siʻitia i sela T o le tumo poʻo sela o le tumo (Ata S3, B ma le C). O le mea lea, o nei taunuuga e faʻaalia ai le faʻamaoni ma le gafatia o la matou tekinolosi vavaeʻesega o sela ma le tele o spectrometry e suʻe ai metabolites taua faʻale-biologically i aano o le gasegase.
O la matou suʻesuʻega na faʻaalia ai foʻi se vaeluaga malosi o le metabolism o ituaiga sela i totonu ma le va o gasegase (Ata 2D ma le Ata S4A). Ae maise lava, pe a faʻatusatusa i isi gasegase, o le gasegase 70 na faʻaalia ai uiga eseese o le metabolism (Ata 2E ma le Ata S4B), o loʻo faʻaalia ai atonu e iai se eseesega tele o le metabolism i le va o gasegase. E taua le maitauina pe a faʻatusatusa i isi gasegase (1.2 i le 2 lita; Laulau S1), o le aofaʻi atoa o ascites na aoina i le gasegase 70 (80 ml) e laʻititi. O le puleaina o le eseesega i le va o gasegase i le taimi o le suʻesuʻega o vaega autu (mo se faʻataʻitaʻiga, faʻaaogaina o le suʻesuʻega faʻaopoopo faʻapitoa) e faʻaalia ai suiga tutusa i le va o ituaiga sela, ma o ituaiga sela ma/poʻo le siosiomaga laiti e faʻapotopotoina manino e tusa ai ma le metabolite profile (Ata 2F). O le suʻesuʻega o metabolites taʻitasi na faʻamamafaina ai nei aafiaga ma faʻaalia ai eseesega taua i le va o ituaiga sela ma le siosiomaga laiti. E taua le maitauina o le eseesega sili ona ogaoga na matauina o le MNA, lea e masani ona faʻamauoa i sela CD45- ma sela CD4+ ma CD8+ e ulu atu i le tumo (Ata 3A). Mo sela CD4 +, o lenei aafiaga e sili ona manino, ma o le MNA i sela CD8 + e foliga mai foi e matua aafia lava i le siosiomaga. Peitai, e le taua lenei mea, aua e na o le toatolu o gasegase e toaono e mafai ona iloiloina mo togi o le tumo CD8+. I le faaopoopo atu i le MNA, i ituaiga eseese o sela i ascites ma tumo, o isi metabolites e le o iloa lelei i le TIL e eseese foi le tele o mea (Ata S3 ma le S4). O le mea lea, o nei faamatalaga e faaalia ai se seti folafolaina o metabolites immunomodulatory mo nisi suesuega.
(A) Fa'atulagaina o le aofa'i o le MNA i totonu o sela CD4+, CD8+ ma le CD45- mai le ascites ma le tumor. O le ata o le pusa o lo'o fa'aalia ai le ogatotonu (laina), le va o le interquartile (fa'avaa fa'avae) ma le va o fa'amaumauga, e o'o atu i le 1.5 taimi o le va o le interquartile (fa'avaa fa'avae). E pei ona fa'amatalaina i Meafaitino ma Metotia a le Tagata Ma'i, fa'aaoga le tau o le limma a le tagata ma'i e fuafua ai le tau o le P (*P<0.05 ma le **P<0.01). (B) Ata fa'ata'ita'i o le metabolism o le MNA (60). Metabolites: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzymes (lanumeamata): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE o le scRNA-seq o ascites (efuefu) ma le tumor (mumu; n = 3 gasegase). (D) Fa'aaliga o le NNMT i vaega eseese o sela ua fa'ailoaina e fa'aaoga ai le scRNA-seq. (E) Fa'aaliga o le NNMT ma le AOX1 i le SK-OV-3, fatuga'o o le pepe o le tagata (HEK) 293T, sela T ma sela T ua togafitia i le MNA. O le fa'aaliga ua gaugau ua fa'aalia e fa'atatau i le SK-OV-3. O le mamanu o le fa'aaliga ma le SEM ua fa'aalia (n = 6 foa'i maloloina). O tau Ct e sili atu i le 35 e manatu e le mafai ona iloa (UD). (F) Fa'aalia o le SLC22A1 ma le SLC22A2 i le SK-OV-3, HEK293T, sela T ma sela T na togafitia i le 8mM MNA. O le fa'aalia gaugau o lo'o fa'aalia e fa'atatau i le SK-OV-3. O lo'o fa'aalia le mamanu o le fa'aalia ma le SEM (n = 6 foa'i maloloina). O tau Ct e sili atu i le 35 e manatu e le mafai ona iloa (UD). (G) O le aofa'i o le MNA o le sela i totonu o sela T foa'i maloloina ua fa'agaoioia pe a uma le 72 itula o le fa'asusuina ma le MNA. O lo'o fa'aalia le mamanu o le fa'aalia ma le SEM (n = 4 foa'i maloloina).
E gaosia le MNA e ala i le fesiitaiga o le vaega methyl mai le S-adenosyl-1-methionine (SAM) i le nicotinamide (NA) e ala i le nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Ata 3B). E tele naua le fa'aalia o le NNMT i le tele o kanesa o tagata ma e feso'ota'i ma le fa'ateleina, osofa'iga ma le metastasis (25-27). Ina ia malamalama atili i le puna o le MNA i sela T i le TME, na matou fa'aogaina le scRNA-seq e fa'ailoa ai le fa'aalia o le NNMT i ituaiga sela i totonu o le ascites ma tumo o gasegase HGSC e to'atolu (Table S5). O le su'esu'ega o le tusa ma le 6,500 sela na fa'aalia ai i totonu o le ascites ma siosiomaga o le tumo, o le fa'aalia o le NNMT sa fa'atapula'aina i le fibroblast ma le tumo cell populations (Ata 3, C ma le D). E taua le maitauina e leai se fa'aalia manino o le NNMT i so'o se faitau aofa'i e fa'aalia ai le PTPRC (CD45 +) (Ata 3D ma le Ata S5A), lea e fa'ailoa mai ai o le MNA na iloa i le metabolite spectrum ua fa'aofiina i totonu o sela T. O le fa'aalia o le aldehyde oxidase 1 (AOX1) e liua ai le MNA i le 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) po'o le 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Ata 3B) e fa'atapula'aina fo'i i le faitau aofa'i o fibroblasts o lo'o fa'aalia le COL1A1 (Ata S5A), lea e fa'ailoa fa'atasi ai e leai se gafatia o sela T e pei o le metabolism masani a le MNA. O le mamanu o le fa'aalia o nei genes e feso'ota'i ma le MNA na fa'amaonia e fa'aaoga ai se seti lona lua o fa'amaumauga tuto'atasi o sela mai ascites mai gasegase HGSC (Ata S5B; n = 6) (16). E le gata i lea, o le su'esu'ega o le quantitative polymerase chain reaction (qPCR) o sela T foa'i maloloina na togafitia i le MNA na fa'aalia ai pe a fa'atusatusa i sela o le ovarian SK-OV-3, e toetoe lava a le fa'aalia le NNMT po'o le AOX1 (Ata 3E). O nei taunu'uga e le'i mafaufauina e fa'aalia ai e ono fa'asa'olotoina le MNA mai fibroblasts po'o tumors i totonu o sela T e lata ane i le TME.
E ui o sui tauva e aofia ai le aiga o mea e feaveaʻi ai le cation organic 1 i le 3 (OCT1, OCT2 ma le OCT3) ua faʻailoa mai e le aiga o le soluble carrier 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ma le SLC22A3), ae o mea e mafai ona feaveaʻi ai le MNA e leʻi faʻamatalaina lava (28). O le QPCR o le mRNA mai sela T foaʻi maloloina na faʻaalia ai le maualalo o le faʻaalia o le SLC22A1 ae le mafai ona iloa le maualuga o le SLC22A2, lea na faʻamaonia ai na lipotia muamua i tusitusiga (Ata 3F) (29). I se faʻatusatusaga, o le laina o le sela o le tumo o le ovarian SK-OV-3 na faʻaalia ai le maualuga o le maualuga o mea e feaveaʻi uma e lua (Ata 3F).
Ina ia fa'ata'ita'i le avanoa e mafai ai e sela T ona mitiia MNA mai fafo, na fa'atupuina ai sela T foa'i maloloina mo le 72 itula i luma o le i ai o le tele o MNA eseese. I le leai o se MNA mai fafo, e le mafai ona iloa le aofa'i o le MNA i totonu o sela (Ata 3G). Peita'i, o sela T fa'agaoioia na togafitia i le MNA mai fafo na fa'aalia ai le fa'ateleina o le aofa'i o le MNA i totonu o sela e fa'alagolago i le fua, e o'o atu i le 6 mM MNA (Ata 3G). O lenei taunu'uga e fa'ailoa mai ai e ui lava i le maualalo o le fa'aalia o le transporter ma le leai o le enzyme autu e nafa ma le metabolism o le MNA i totonu o le sela, e mafai lava e le TIL ona ave le MNA.
O le tele o metabolites i totonu o sela T a gasegase ma faʻataʻitaʻiga o le mitiia o le MNA in vitro e faʻateleina ai le avanoa e faʻasaʻoloto ai e fibroblasts e fesoʻotaʻi ma le kanesa (CAF) le MNA ma e ono faʻatonutonuina e sela o le tumo le phenotype ma le galuega a le TIL. Ina ia iloa le aʻafiaga o le MNA i sela T, na faʻagaoioia sela T foaʻi maloloina i totonu o le vitro i le i ai poʻo le leai o le MNA, ma iloiloina lo latou faʻateleina ma le gaosiga o le cytokine. Ina ua mavae aso e 7 o le faʻaopoopoina o le MNA i le fua aupito maualuga, na faʻaitiitia le numera faaluaina o le faitau aofaʻi, aʻo faʻatumauina le malosi i fua uma (Ata 4A). E le gata i lea, o le togafitiga o le MNA exogenous na mafua ai le faʻateleina o le vaega o sela CD4 + ma le CD8 + T o loʻo faʻaalia ai le tumor necrosis factor-α (TNFα; Ata 4B). I se faʻatusatusaga, o le gaosiga o le IFN-γ i totonu o le sela na matua faʻaitiitia i sela CD4 + T, ae le o sela CD8 + T, ma e leai se suiga taua i le interleukin 2 (IL-2; Ata 4, C ma le D). O le mea lea, o le enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) o supernatants mai nei fa'ato'aga sela T ua togafitia i le MNA ua fa'aalia ai se fa'aopoopoga tele i le TNFα, o se fa'aitiitia i le IFN-γ, ma leai se suiga i le IL-2 (Ata 4, E i le G). . O le fa'aitiitia o le IFN-γ ua fa'ailoa mai ai e ono i ai se sao o le MNA i le taofia o le gaioiga fa'asaga i le tumo o sela T. Ina ia fa'ata'ita'i le a'afiaga o le MNA i le cytotoxicity e fa'atinoina e sela T, o sela chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) e fa'atatau i le folate receptor α ma le CAR-T (GFP) e fa'atonutonuina e sela green fluorescent protein (GFP) -CAR-T) e gaosia e sela soifua maloloina o le donor peripheral blood mononuclear (PBMC). O sela CAR-T na fa'afaileleina mo le 24 itula i luma o le MNA, ona fa'afaileleina fa'atasi lea ma sela o le tumo o le ovarian SK-OV-3 o le tagata e fa'aalia ai le folate receptor α i le fua fa'atatau o le effector i le target o le 10:1. O togafitiga MNA na iu ai i le faaitiitia tele o le gaioiga fasioti tagata o sela FRα-CAR-T, lea e tutusa ma sela FRα-CAR-T na togafitia i le adenosine (Ata 4H).
(A) Aofa'i o sela olaola ma le fa'aluaina o le faitau aofa'i (PD) sa'o mai le fa'ato'aga i le aso 7. O le kalafi pa e fa'atusalia ai le averesi + SEM o foa'i maloloina e to'aono. O lo'o fa'atusalia ai fa'amatalaga mai le itiiti ifo i le n = 3 fa'ata'ita'iga tuto'atasi. (B i le D) CD3/CD28 ma le IL-2 na fa'aaogaina e fa'agaoioia ai sela T i o latou MNA ta'itasi mo le 7 aso. A'o le'i faia le su'esu'ega, na fa'aosofia sela i le PMA/ionomycin ma le GolgiStop mo le 4 itula. Fa'aaliga o le TNFα (B) i sela T. Fa'ata'ita'iga ata (agavale) ma fa'amaumauga laulau (taumatau) o le fa'aaliga o le TNFα i sela ola. Fa'aaliga o le IFN-γ (C) ma le IL-2 (D) i sela T. O le fa'aaliga o cytokines na fuaina e ala i le flow cytometry. O le kalafi pa e fa'atusalia ai le averesi (n = 6 foa'i maloloina) + SEM. Fa'aaoga le au'ili'iliga o le eseesega i le itu e tasi ma fua fa'asolosolo (*P<0.05 ma le **P<0.01) e fuafua ai le tau o le P. O lo'o fa'atusalia ai fa'amatalaga mai le itiiti ifo i le n = 3 fa'ata'ita'iga tuto'atasi. (E i le G) Sa fa'aaogaina le CD3/CD28 ma le IL-2 e fa'agaoioia ai sela T i o latou tulaga maualuga o le MNA mo le 7 aso. Sa aoina le vaila'au a'o le'i o'o i le 4 itula o le fa'aosofiaga o le PMA/ionomycin ma ina ua mae'a. O le maualuga o le TNFα (E), IFN-γ (F) ma le IL-2 (G) sa fuaina e le ELISA. O le kalafa pa e fa'atusalia ai le averesi (n = 5 foa'i maloloina) + SEM. O le tau P ua fuafuaina e fa'aaoga ai le au'ili'iliga o le eseesega i le itu e tasi ma fua fa'asolosolo (*P<0.05). O le laina togitogi e fa'ailoa mai ai le tapula'a o le iloa o le iloa. (H) Su'ega o le lysis o le sela. O sela FRα-CAR-T po'o le GFP-CAR-T sa fetu'una'i i le adenosine (250μM) po'o le MNA (10 mM) mo le 24 itula, pe tu'ua e le'i togafitia (Ctrl). O le pasene o le fasiotia o sela SK-OV-3 sa fuaina. O le tau P ua fuafuaina e le su'ega t Welch (*P<0.5 ma le **P<0.01).
Ina ia maua se malamalamaga fa'amekanika o le fa'atonutonuina o le fa'aalia o le TNFα e fa'alagolago i le MNA, na iloiloina ai suiga i le TNFα mRNA o sela T na togafitia i le MNA (Ata 5A). O sela T foa'i maloloina na togafitia i le MNA na fa'aalia ai le fa'ateleina fa'aluaina o le maualuga o le fa'aliliuga o le TNFα, ma fa'ailoa mai ai o le MNA e fa'alagolago i le fa'atonutonuina o le fa'aliliuga o le TNFα. Ina ia su'esu'eina lenei faiga fa'atonutonu e ono mafai, e lua mea fa'aliliuga ua iloa e fa'atonutonuina ai le TNFα, o le activated T cell nuclear factor (NFAT) ma le protein patino 1 (Sp1), na iloiloina e tali atu ai i le fusifusia o le MNA i le proximal TNFα promoter (30). O le TNFα promoter o lo'o i ai nofoaga e 6 ua fa'ailoaina e fusifusia ai le NFAT ma nofoaga e 2 e fusifusia ai le Sp1, e fe'avea'i i le tasi nofoaga [-55 base pairs (bp) mai le 5'cap] (30). O le Chromatin immunoprecipitation (ChIP) na fa'aalia ai ina ua togafitia i le MNA, o le fusifusia o le Sp1 i le TNFα promoter na fa'ateleina fa'atolu. O le tu'ufa'atasia o le NFAT na fa'ateleina fo'i ma ua latalata i le taua (Ata 5B). O nei faʻamaumauga e faʻaalia ai o le MNA e faʻatonutonuina le faʻaalia o le TNFα e ala i le Sp1 transcription, ma i se tulaga maualalo ifo o le faʻaalia o le NFAT.
(A) Pe a fa'atusatusa i sela T na totoina e aunoa ma le MNA, o le suiga o le fa'aaliga o le TNFα i sela T na togafitia i le MNA. O lo'o fa'aalia le mamanu o le fa'aaliga ma le SEM (n = 5 foa'i maloloina). O lo'o fa'atusalia ai fa'amatalaga mai le itiiti ifo i le n = 3 fa'ata'ita'iga tuto'atasi. (B) O le TNFα promoter o sela T na togafitia i le pe leai foi o le 8 mM MNA ina ua mae'a ona tu'ufa'atasia le NFAT ma le Sp1 ma le (Ctrl) ma le fa'aosofiaina o le PMA/ionomycin mo le 4 itula. Na fa'aaogaina le Immunoglobulin G (IgG) ma le H3 o ni fa'atonutonu lelei ma lelei mo le immunoprecipitation. O le fuaina o le ChIP na fa'aalia ai o le fusifusia o le Sp1 ma le NFAT i le TNFα promoter i sela na togafitia i le MNA na fa'ateleina i ni nai taimi pe a fa'atusatusa i le fa'atonutonu. O lo'o fa'atusalia ai fa'amatalaga mai le itiiti ifo i le n = 3 fa'ata'ita'iga tuto'atasi. O le tau o le P na fuafuaina e ala i le tele o t-tests (*** P <0.01). (C) Pe a fa'atusatusa i le ascites o le HGSC, o sela T (e le oona) na fa'aalia ai le fa'ateleina o le fa'aaliga o le TNF i le tumo. O lanu e fa'atusalia ai gasegase eseese. O sela o loʻo faʻaalia ua faʻataʻitaʻiina faʻafuaseʻi i le 300 ma faʻaosoosoina e faʻatapulaʻa ai le soʻona tosoina (** Padj = 0.0076). (D) Faʻataʻitaʻiga fautuaina o le MNA mo le kanesa o le ovarian. E gaosia le MNA i sela o le tumo ma fibroblasts i le TME ma e aveina e sela T. E faʻateleina e le MNA le fusifusia o le Sp1 i le TNFα promoter, e mafua ai ona faʻateleina le TNFα transcription ma le gaosiga o le TNFα cytokine. E mafua ai foʻi e le MNA le faʻaitiitia o le IFN-γ. O le taofiofia o le galuega a le sela T e mafua ai ona faʻaitiitia le mafai ona fasiotia ma faʻavavevaveina le tuputupu aʻe o le tumo.
E tusa ai ma lipoti, o le TNFα e iai ona aafiaga e fa'alagolago i luma ma tua i le tete'e atu i le tumo ma le tete'e atu i le tumo, ae e iai sona sao lauiloa i le fa'alauiloaina o le tuputupu a'e ma le metastasis o le kanesa o le ovarian (31-33). E tusa ai ma lipoti, o le maualuga o le TNFα i ascites ma aano o le tumo i tagata mama'i e maua i le kanesa o le ovarian e maualuga atu nai lo aano e le afaina (34-36). I tulaga o le faiga, e mafai e le TNFα ona fa'atonutonuina le fa'agaoioiga, galuega ma le fa'ateleina o sela toto pa'epa'e, ma suia le phenotype o sela kanesa (37, 38). E ogatasi ma nei sailiiliga, o le su'esu'ega o le fa'aalia o kenera eseese na fa'aalia ai o le TNF sa matua'i fa'ateleina i sela T i aano o le tumo pe a fa'atusatusa i ascites (Ata 5C). O le fa'ateleina o le fa'aalia o le TNF sa na'o le va'aia i vaega o sela T ma se phenotype e le oona (Ata S5A). I ​​se aotelega, o nei fa'amaumauga e lagolagoina ai le manatu o le MNA e iai ni aafiaga e lua e taofia ai le puipuiga o le tino ma le fa'alauiloaina o le tumo i le HGSC.
O le fa'ailogaina o le fluorescent e fa'avae i luga o le flow cytometry ua avea ma metotia autu mo le su'esu'eina o le metabolism o le TIL. O nei su'esu'ega ua fa'aalia ai pe a fa'atusatusa i lymphocytes toto peripheral po'o sela T mai totoga lymphoid lona lua, o le murine ma le TIL o le tagata e sili atu le malosi e mitiia ai le kulukose (4, 39) ma le mou atu malie o le galuega a le mitochondrial (19, 40). E ui ina ua matou matauina ni taunuuga tutusa i lenei su'esu'ega, o le atina'e autu o le fa'atusatusaina lea o le metabolism o sela o le tumo ma le TIL mai le aano lava e tasi o le tumo ua tipi ese. E ogatasi ma nisi o nei lipoti muamua, o sela o le tumo (CD45-EpCAM +) mai ascites ma tumo e sili atu le maualuga o le mitiia o le kulukose nai lo sela CD8 + ma CD4 + T, e lagolagoina ai le maualuga o le mitiia o le kulukose o sela o le tumo e mafai ona fa'atusatusa i sela T. O le manatu o le tauvaga o sela T. TME. Peita'i, o le gaioiga mitochondrial o sela o le tumo e maualuga atu nai lo sela CD8 + T, ae o le gaioiga mitochondrial e tutusa ma sela CD4 + T. O nei taunuuga e fa'amalosia ai le autu fou o le metabolism oxidative e taua mo sela o le tumo (41, 42). Latou te fautua mai foi e ono sili atu ona faigofie ona aafia sela CD8 + T i le faaletonu o le oxidative nai lo sela CD4 + T, pe atonu e faaaoga e sela CD4 + T ni punaoa kaponi e ese mai le kulukose e faatumauina ai le gaioiga o le mitochondrial (43, 44). E tatau ona maitauina e leai se eseesega na matou matauina i le glucose uptake po o le gaioiga o le mitochondrial i le va o CD4 + T effectors, T effector memory ma T central memory cells i ascites. I se tulaga tutusa, o le tulaga o le eseesega o sela CD8 + T i tumo e leai se sootaga ma suiga i le glucose uptake, ma faailoa mai ai le eseesega tele i le va o sela T na totoina i vitro ma le TIL a le tagata i vivo (22). O nei matauga na faamaonia foi e ala i le faaaogaina o le unbiased automatic cell population distribution, lea na faaalia atili ai o sela CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + e maualuga atu le glucose uptake ma le gaioiga o le mitochondrial nai lo sela tumo e taatele ae o loʻo i ai le Metabolic active cell population. O lenei faitau aofaʻi e ono fai ma sui o le subpopulation o sela myeloid suppressor po o sela plasmacytoid dendritic na faailoa mai i le scRNA-seq analysis. E ui lava ina lipotia mai nei mea uma e lua i tumo o le ovary o tagata [45], ae o loʻo manaʻomia pea nisi galuega o le faʻamatalaina lea o lenei myeloid subpopulation.
E ui lava e mafai e metotia fa'avae i le flow cytometry ona fa'amaninoina eseesega lautele i le glucose ma le oxidative metabolism i le va o ituaiga sela, ae o metabolites tonu na gaosia e le glucose po'o isi punaoa kaponi mo le mitochondrial metabolism i le TME e le'i fa'amautuina lava. O le tofiaina o le i ai po'o le leai o metabolites i se vaega TIL ua tu'uina atu e mana'omia ai le fa'amamāina o le faitau aofa'i o sela mai le a'ano ua tipi ese. O le mea lea, o la matou metotia fa'amauoa sela fa'atasi ai ma le mass spectrometry e mafai ona maua ai ni malamalamaga i metabolites o lo'o fa'amauoa eseese i sela T ma faitau aofa'i o sela tumo i fa'ata'ita'iga fa'atusatusa a tagata ma'i. E ui o lenei metotia e iai ona lelei nai lo le fluorescence-activated cell sorting, o nisi o faletusi metabolite e ono a'afia ona o le mautu masani ma/po'o le vave o le turnover (22). Ae ui i lea, na mafai e la matou metotia ona fa'ailoa mai ni metabolites se lua ua iloa e taofia ai le puipuiga o le tino, adenosine ma kynurenine, aua e matua eseese lava i le va o ituaiga fa'ata'ita'iga.
O la matou suʻesuʻega metabonomic o tumo ma TIL subtypes e maua ai nisi malamalamaga i le matafaioi o metabolites i le ovarian TME. Muamua, i le faʻaaogaina o le flow cytometry, na matou iloa ai e leai se eseesega i le gaioiga mitochondrial i le va o tumo ma CD4 + T cells. Peitaʻi, o le suʻesuʻega LC-MS/MS na faʻaalia ai suiga taua i le tele o metabolites i totonu o nei faitau aofaʻi, ma faʻaalia ai o faʻaiʻuga e uiga i le metabolism TIL ma lona gaioiga metabolic lautele e manaʻomia ai le faʻamatalaina ma le faʻaeteete. Lua, o le MNA o le metabolite e sili ona tele le eseesega i le va o CD45-cells ma T cells i ascites, ae le o tumo. O le mea lea, o le vaevaega ma le nofoaga o le tumo e ono i ai ni aafiaga eseese i le metabolism TIL, lea e faʻamamafa ai le heterogeneity e ono i ai i se microenvironment tuʻuina atu. Tolu, o le faʻaalia o le MNA-producing enzyme NNMT e faʻatapulaʻaina tele lava i le CAF, o sela tumo i se tulaga maualalo, ae o tulaga MNA e mafai ona iloa e matauina i sela T e maua mai i le tumo. O le soona faʻaalia o le NNMT i le ovarian CAF e i ai se aafiaga e iloa e faʻalauiloa ai le kanesa, ona o le faʻalauiloaina o le metabolism CAF, osofaʻiga o le tumo ma le metastasis (27). E ui o le tulaga lautele o le TIL e feololo, o le faʻaalia o le NNMT i le CAF e fesoʻotaʻi vavalalata ma le Cancer Genome Atlas (TCGA) mesenchymal subtype, lea e fesoʻotaʻi ma le leaga o le prognosis (27, 46, 47). Ma le mea mulimuli, o le faʻaalia o le enzyme AOX1 e nafa ma le faʻaleagaina o le MNA e faʻatapulaʻaina foʻi i le faitau aofaʻi o le CAF, lea e faʻaalia ai e leai se gafatia o sela T e faʻamaʻaʻaina le MNA. O nei taunuuga e lagolagoina ai le manatu e ui lava e manaʻomia nisi galuega e faʻamaonia ai lenei sailiga, o le maualuga o le MNA i sela T e ono faʻaalia ai le iai o se siosiomaga CAF e taofia ai le puipuiga o le tino.
Ona o le maualalo o le tulaga o le fa'aalia o MNA transporters ma le le mafai ona iloa o polotini autu e a'afia i le metabolism o le MNA, o le i ai o le MNA i totonu o sela T e le o se mea e fa'amoemoeina. E le mafai ona iloa le NNMT po'o le AOX1 e ala i le su'esu'ega scRNA-seq ma le qPCR fa'atatauina o vaega tuto'atasi e lua. O nei taunuuga e fa'aalia ai e le o gaosia le MNA e sela T, ae mitiia mai le TME o lo'o siomia ai. O fa'ata'ita'iga in vitro e fa'aalia ai e masani ona fa'aputu e sela T ni MNA mai fafo.
O a matou suʻesuʻega i totonu o le vitro ua faʻaalia ai o le MNA mai fafo e faʻaosofia ai le faʻaalia o le TNFα i totonu o sela T ma faʻaleleia atili ai le fusifusia o le Sp1 i le TNFα promoter. E ui o le TNFα e iai galuega e teteʻe ai i le tumo ma le teteʻe i le tumo, i le kanesa o le ovarian, e mafai e le TNFα ona faʻalauteleina le tuputupu aʻe o le kanesa o le ovarian (31-33). O le faʻaitiitia o le TNFα i le faʻatoʻaga o sela o le tumo o le ovarian poʻo le faʻaumatia o le faʻailoga TNFα i faʻataʻitaʻiga isumu e mafai ona faʻaleleia atili ai le gaosiga o le cytokine mumū e mafua mai i le TNFα ma taofia ai le tuputupu aʻe o le tumo (32, 35). O le mea lea, i lenei tulaga, o le MNA e maua mai i le TME e mafai ona galue o se metabolite pro-inflammatory e ala i se faiga e faʻalagolago i le TNFα e ala i le autocrine loop, ma faʻalauteleina ai le tupu ma le salalau o le kanesa o le ovarian (31). E faʻavae i luga o lenei mea e ono tupu, o loʻo suʻesuʻeina le poloka o le TNFα o se vailaʻau faʻamalolo mo le kanesa o le ovarian (37, 48, 49). E le gata i lea, e faʻaleagaina e le MNA le cytotoxicity o sela CAR-T i sela o le tumo o le ovarian, ma maua ai nisi faʻamaoniga mo le taofiofia o le puipuiga o le tino e mafua mai i le MNA. O nei taunuuga e faʻaalia ai se faʻataʻitaʻiga e faʻasaʻoloto ai e tumo ma sela CAF le MNA i totonu o le TME i fafo atu o le sela. E ala i le (i) faʻaosofiaina o le tuputupu aʻe o le kanesa o le ovarian e mafua mai i le TNF ma le (ii) taofia o le gaioiga oona o sela T e mafua mai i le MNA, e ono i ai se aafiaga lua o le tumo (Ata 5D).
I le faaiuga, i le faaaogaina o le tuufaatasiga o le faʻateleina vave o sela, faasologa o sela e tasi ma le faʻavasegaina o le metabolism, o lenei suʻesuʻega na faʻaalia ai eseesega tetele o le immunometabolomic i le va o tumo ma sela ascites i gasegase HGSC. O lenei auiliiliga atoatoa na faʻaalia ai o loʻo i ai eseesega i le faʻaaogaina o le kulukose ma le gaioiga o le mitochondrial i le va o sela T, ma faʻailoa ai le MNA o se metabolite faʻatonutonu puipuiga tutoʻatasi e le o se sela. O nei faʻamaumauga e iai sona aafiaga i le auala e aʻafia ai e le TME le metabolism o sela T i kanesa o tagata. E ui lava ina lipotia mai le tauvaga tuusaʻo mo meaʻai i le va o sela T ma sela kanesa, ae mafai foi e metabolites ona avea o ni faʻatonutonu e le tuusaʻo e faʻalauiloa ai le alualu i luma o le tumo ma atonu e taofia ai tali puipuia o le tino. O le faʻamatalaga atili o le matafaioi faatino a nei metabolites faʻatonutonu e ono tatalaina ai ni isi auala mo le faʻaleleia atili o le tali puipuia o le teteʻe i le tumo.
Na maua faʻataʻitaʻiga o gasegase ma faʻamatalaga faafomaʻi e ala i le nofoaga e teu ai aano o le kanesa o le BC ua faʻamaonia e le Canadian Tissue Repository Network. E tusa ai ma le faʻatulagaga ua faʻamaonia e le BC Cancer Research Ethics Committee ma le Iunivesite o British Columbia (H07-00463), o faʻataʻitaʻiga uma a gasegase ma faʻamatalaga faafomaʻi na maua ai se maliega tusitusia faʻamatalaina pe faʻaleaogaina aloaia la latou maliega. O faʻataʻitaʻiga o loʻo teuina i le BioBank ua faʻamaonia (BRC-00290). O faʻamatalaga auiliili o le gasegase o loʻo faʻaalia i le Laulau S1 ma le S5. Mo le cryopreservation, e faʻaaogaina se scalpel e faʻaleagaina ai le faʻataʻitaʻiga o le kanesa o le gasegase ona tulei lea i totonu o se faamama 100-micron e maua ai se sela e tasi e faʻasusu. O le ascites o le gasegase na centrifuged i le 1500 rpm mo le 10 minute i le 4°C e pellet ai sela ma aveese le supernatant. O sela na maua mai le tumo ma le ascites na fa'asaoina i le cryopreserve i le 50% o le serum AB a le tagata ua fa'agata i le vevela (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ma le 10% dimethyl sulfoxide. O nei fa'asusuga sela ta'itasi na fa'asaoina na fa'amaluluina ma fa'aaoga mo le metabolomics ma le fuafuaina o metabolite o lo'o fa'amatalaina i lalo.
O le vailaʻau atoa e aofia ai le 0.22 μm faʻamamāina 50:50 faʻaopoopo i le RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) faʻaopoopo i le 10% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) solution (Thermo Fisher Scientific) ma le 50 μMB-mercaptoethanol. O le AimV (Invitrogen) e faʻaopoopo i le 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ma le 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). O le flow cytometer staining buffer e aofia ai le 0.22μm filtered phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) faʻaopoopo i le 3% heat-inactivated AB human serum (Sigma). O le buffer fa'amauoa o le sela e aofia ai le 0.22μm PBS ua fa'amamāina ma fa'aopoopoina i le 0.5% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich).
I totonu o le vailaʻau atoa e 37°C, na valiina ai sela i le 10 nM MT DR ma le 100 μM 2-NBDG mo le 30 minute. Sosoo ai, na valiina sela i le vali olaola eF506 i le 4°C mo le 15 minute. Toe faʻasusu sela i le FC Block (eBioscience) ma le Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), faʻafefiloi i le flow cytometer staining buffer (e tusa ai ma faʻatonuga a le kamupani gaosi oloa), ma faʻasusu mo le 10 minute i le vevela o le potu. Vali sela i se seti o antibodies (Table S2) i le flow cytometry staining buffer i le 4°C mo le 20 minute. Toe faʻasusu sela i le flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) aʻo leʻi faia le suʻesuʻega. Faaaoga le SpectroFlo ma le FlowJo V10 e iloilo ai faʻamatalaga o le aofaʻi o sela, ma faʻaaoga le GraphPad Prism 8 e fatu ai faʻamatalaga. O le median fluorescence intensity (MFI) o le 2-NBDG ma le MT DR sa fa'atulagaina i le log, ona fa'aaogaina lea o se paired t test mo le au'ili'iliga fa'amaumauga e fa'atatau ai gasegase tutusa. Ave'ese vaega uma e itiiti ifo i le 40 mea na tutupu mai le au'ili'iliga; fa'aofi se tau MFI o le 1 mo so'o se tau le lelei a'o le'i faia le au'ili'iliga fa'amaumauga ma le fa'aalia o fa'amaumauga.
Ina ia fa'aopoopoina le fuafuaga fa'atonutonu lima o le fa'agasologa o lo'o i luga, na matou fa'aaogaina le fa'amatalaga atoa e ala i le la'au fa'atapula'aina o foliga (FAUST) (21) e fa'atulaga otometi ai sela i le faitau aofa'i pe a uma ona ave'ese sela ua mate i le FlowJo. Matou te pulea lima le output e tu'ufa'atasia ai faitau aofa'i e foliga mai ua sese le vaevaeina (tu'ufa'atasia o le PD1+ ma sela PD1-tumor) ma faitau aofa'i ua taofia. O fa'ata'ita'iga ta'itasi e iai le averesi o le sili atu i le 2% o sela, mo le aofa'i atoa o faitau aofa'i e 11.
Sa fa'aaogaina le Ficoll gradient density centrifugation e vavae'ese ai le PBMC mai oloa vavae'ese o leukocyte (STEMCELL Technologies). Sa vavae'eseina sela CD8 + T mai le PBMC e fa'aaoga ai le CD8 MicroBeads (Miltenyi) ma fa'alauteleina i totonu o se auala atoatoa e fa'aaoga ai le TransAct (Miltenyi) mo le 2 vaiaso e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi. Sa tu'u sela e tu mo le 5 aso i totonu o se auala atoatoa o lo'o i ai le IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ona toe fa'aosofia lea i le TransAct. I le aso 7, e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi, sa fa'aaogaina ai le human CD45 MicroBeads (Miltenyi) e fa'amauoa ai sela i ta'amilosaga sosoo e tolu. Sa vaevaeina sela mo le su'esu'ega o le flow cytometry (e pei ona fa'amatalaina i luga), ma le tasi le miliona sela sa vaevaeina fa'atolu mo le su'esu'ega o le LC-MS/MS. Sa fa'agasoloina fa'ata'ita'iga e le LC-MS/MS e pei ona fa'amatalaina i lalo. Sa matou fa'atatauina le tau o le metabolite ua misi ma se numera ion e 1,000. O faʻataʻitaʻiga taʻitasi e faʻatulagaina e le aofaʻi o le ion number (TIC), faʻaliliuina faʻasolosolo ma otometi lava ona faʻatulagaina i le MetaboAnalystR aʻo leʻi faia le suʻesuʻega.
O le fa'asusuina o sela e tasi o gasegase ta'itasi na fa'amalūlūina ma fa'amamāina e ala i se fa'amama 40 μm i totonu o se vaega atoatoa (e pei ona fa'amatalaina i luga). E tusa ai ma le fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa, e tolu ta'amilosaga sosoo o le filifiliga lelei e ala i le vavae'eseina o le magnetic bead e fa'aaoga ai MicroBeads (Miltenyi) na fa'aaogaina e fa'amauoa ai fa'ata'ita'iga mo sela CD8+, CD4+ ma le CD45- (i luga o le aisa). I se aotelega, o sela e toe fa'asusuina i totonu o le cell enrichment buffer (e pei ona fa'amatalaina i luga) ma faitauina. O sela na fa'asusuina i le human CD8 beads, human CD4 beads po'o human CD45 beads (Miltenyi) i le 4°C mo le 15 minute, ona fufulu lea i le cell enrichment buffer. O le fa'ata'ita'iga e pasia i le LS column (Miltenyi), ma aoina vaega lelei ma vaega leaga. Ina ia fa'aitiitia le umi ma fa'ateleina le la'asaga o le toe fa'aleleia o sela, ona fa'aaoga lea o le CD8-fraction mo le ta'amilosaga lona lua o le fa'amauoa o le CD4+, ma fa'aaoga le CD4-fraction mo le fa'amauoa o le CD45 mulimuli ane. Taofi le vaila'au i luga o le aisa i le taimi atoa o le vavae'eseina.
Mo le sauniaina o faʻataʻitaʻiga mo le suʻesuʻeina o metabolite, na fufuluina faʻatasi sela i le vai masima malulu, ma faʻaopoopoina le 1 ml o le 80% methanol i faʻataʻitaʻiga taʻitasi, ona faʻavilivili lea ma faʻaʻaisa i le nitrogen vai. Na faia faʻataʻitaʻiga i taʻamilosaga faʻaʻaisa-faʻasusu e tolu ma faʻacentrifuge i le 14,000 rpm mo le 15 minute i le 4°C. O le supernatant o loʻo i ai metabolites e faʻamamago seʻia mago. Na toe faʻafefiloi metabolites i le 50 μl o le 0.03% formic acid, faʻavilivili e palu, ona faʻacentrifuge lea e aveese ai otaota.
Aveese metabolites e pei ona faʻamatalaina i luga. Faʻaliliu le supernatant i totonu o se fagu chromatography vai maualuga le faatinoga mo suʻesuʻega metabolomics. Faaaoga se faiga togafitiga faʻafuaseʻi e togafitia ai faʻataʻitaʻiga taʻitasi i se numera tutusa o sela e puipuia ai aafiaga o le batch. Na matou faia se iloiloga agavaa o metabolites i le lalolagi atoa na lolomiina muamua i luga o le AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). O le auʻiliʻiliga chromatographic ma le tuʻufaʻatasia o le peak area na faia e faʻaaoga ai le polokalama MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
O le aofaʻi o ion e 1000 na faʻaaogaina e faʻatatau ai le tau o le metabolite ua misi, ma le TIC o faʻataʻitaʻiga taʻitasi na faʻaaogaina e fuafua ai le vaega pito i luga masani o metabolite taʻitasi na iloa e faʻasaʻo ai suiga na faʻalauiloa mai e le auʻiliʻiliga meafaigaluega mai le faʻagasologa o faʻataʻitaʻiga. A maeʻa ona faʻatulagaina le TIC, e faʻaaogaina le MetaboAnalystR(51) (parameter masani) mo le liua logarithmic ma le faʻatulagaina otometi o laina masani. Na matou faʻaaogaina le PCA ma le afifi vegan R e faia ai le auʻiliʻiliga suʻesuʻe o eseesega o metabolome i le va o ituaiga faʻataʻitaʻiga, ma faʻaaogaina le auʻiliʻiliga faʻaopoopo faʻapitoa e auʻiliʻili ai maʻi. Faaaoga le metotia a Ward e fausia ai se dendrogram o le faʻafanua vevela e faʻaputu ai le mamao Euclidean i le va o faʻataʻitaʻiga. Na matou faʻaaogaina le limma (52) i luga o le tele o metabolite faʻatulagaina e faʻailoa ai metabolites eseese i le ituaiga atoa o sela ma le siosiomaga laiti. Ina ia faʻafaigofieina le faʻamatalaga, matou te faʻaaogaina le parameter averesi o le vaega e faʻamaoti ai le faʻataʻitaʻiga, ma mafaufau i ituaiga sela i le siosiomaga laiti o vaega taʻitasi (n = 6 vaega); mo le suʻega taua, na matou faia ni fua faʻatatau se tolu mo metabolite taʻitasi Ina ia ʻalofia le toe faia sese, na aofia ai le maʻi o se faʻalavelave i le mamanu limma. Ina ia siaki le eseesega o metabolites i le va o gasegase eseese, na matou fetu'una'ia le limma model e aofia ai gasegase i se auala tumau. Matou te lipotia le taua o le eseesega ua uma ona fa'amaoti mai i le va o le ituaiga sela ma le siosiomaga laiti o Padj <0.05 (fa'asa'oga a Benjamini-Hochberg).
A maeʻa ona faʻamalosia le malosi e faʻaaoga ai le Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% le ola), na faia ai le faʻasologa o le transcriptome o sela e tasi i luga o le aofaʻi atoa o ascites ma faʻataʻitaʻiga o le tumo ua faʻaʻaisa e faʻaaoga ai le 10x 5′gene expression protocol. E lima mataupu ma tumo tutusa ma ascites na iloiloina, e ui o le maualalo o le ola mai le tasi faʻataʻitaʻiga o le tumo na taofia ai lona aofia ai. Ina ia ausia le tele o filifiliga o gasegase, na matou tuʻufaʻatasia faʻataʻitaʻiga o gasegase taʻitasi i totonu o le 10x chromium controller, ma iloiloina eseese ascites ma nofoaga o le tumo. A maeʻa ona faʻasologa [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp paired end (PE), Quebec genome; o le averesi o le 73,488 ma le 41,378 faitauga i le sela mo le tumo ma le ascites]], na matou faʻaaogaina le CellSNP ma le Vireo (53) (e faʻavae i luga o le CellSNP e pei o le O le SNP masani a le tagata (VCF) na saunia e le GRCh38 ua tofia i ai se faasinomaga o le foai. Matou te faʻaaogaina le SNPRelate e faʻailoa ai le faasinomaga e sili ona latalata (IBS) o le tulaga o le genotype o le maʻi (IBS), e le aofia ai sela e leʻi tofiaina ma sela ua faʻailoaina o ni duplexes ma le fetaui o foai i le va o ascites ma faʻataʻitaʻiga o le tumo (54). I luga o le faʻavae o lenei galuega, na matou taofia ai mataupu e tolu ma le tele o faʻatusa o sela i le tumo ma le ascites mo le suʻesuʻega i lalo. Ina ua maeʻa ona faia se laʻasaga o le faʻamamaina tele i le afifiina o le scater (55) ma le scran (56) BioConductor, na maua ai le 6975 sela (2792 ma le 4183 sela mai le tumo ma le ascites, i le faʻasologa) mo le suʻesuʻega. Matou te faʻaaogaina le faʻaputuga o Louvain a le igraph (57) o le fesoʻotaʻiga tuaoi sili ona latalata (SNN) e faʻavae i luga o le mamao o Jaccard i sela o le cluster e ala i le faʻaalia. Sa fa'ailoa lima ia vaega i ituaiga sela e ono fa'atatau i le fa'aalia o le kenera fa'ailoga ma va'aia i le t-SNE. O sela T cytotoxic e fa'amatalaina e le fa'aalia o le CD8A ma le GZMA, e le aofia ai vaega laiti e maualalo le fa'aalia o le porotini ribosomal. Na matou mauaina fa'amaumauga lomia a Izar et al. (16), e aofia ai lo latou fa'apipi'iina o le t-SNE, e mafai ona pulea le fa'aalia o le fe'avea'i i le va o fa'ailoga o sela puipuia ma le fa'aalia o le NNMT.
Sa vavae’eseina le PBMC mai oloa vavae’eseina o leukocyte (STEMCELL Technologies) e ala i le Ficoll gradient density centrifugation. Sa vavae’eseina sela CD3 + mai le PBMC e fa’aaoga ai CD3 beads (Miltenyi). I le i ai pe leai foi o le MNA, sa fa’agaoioia sela CD3+ i le plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) ma le IL-2 (300 U/ml; Proleukin). I le aso mulimuli o le fa’alauteleina, sa iloiloina ai le olaola (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ma le fa’ateleina (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) e ala i le flow cytometry. Iloilo le galuega a le effector e ala i le fa'aosofiaina o sela i le PMA (20 ng/ml) ma le ionomycin (1μg/ml) i le GolgiStop mo le 4 itula, ma mata'ituina le CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ma le TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Fa'aosofia sela qPCR ma ChIP i le PMA (20 ng/ml) ma le ionomycin (1μg/ml) mo le 4 itula. O le ELISA supernatant na aoina a'o le'i faia ma ina ua mae'a le fa'aosofiaina i le PMA (20 ng/ml) ma le ionomycin (1 μg/ml) mo le 4 itula.
Mulimuli i le fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa e vavae'ese ai le RNA e fa'aaoga ai le RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Fa'aaoga le QIAshredder (QIAGEN) e fa'afefiloi ai le fa'ata'ita'iga. Fa'aaoga le RNA maualuga le gafatia i le cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) e fa'aputu ai le DNA fa'aopoopo (cDNA). Fa'aaoga le TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) e fa'atatau ai le fa'aalia o kene (e tusa ai ma le fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa) fa'atasi ai ma su'ega nei: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] ma le Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sa fa'atinoina fa'ata'ita'iga i luga o le StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) i totonu o le MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) fa'atasi ai ma le MicroAmp optical film. So'o se tau Ct e sili atu i le 35 e manatu ua sili atu i le tulaga maualuga o le iloa ma ua fa'ailogaina o se mea e le mafai ona iloa.
Fa'atino le ChIP e pei ona fa'amatalaina muamua (58). I se aotelega, na togafitia sela i le formaldehyde (o le fa'aputuga mulimuli e 1.42%) ma fa'asusu i le vevela o le potu mo le 10 minute. Fa'aaoga le fa'aopoopoga o le swelling buffer (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ma le 0.1% NP-40) i luga o le aisa mo le 10 minute, ona toe fa'asusu lea i totonu o le immunoprecipitation buffer e pei ona fa'amatalaina (58). Ona sonicated lea o le fa'ata'ita'iga i ta'amilosaga nei: 10 ta'amilosaga (20 1-sekone pulses) ma se taimi tumau e 40 sekone. Fa'asusu ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ma le SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antibodies fa'atasi ai ma le fa'ata'ita'iga i le 4°CC lulu i le po atoa. Fa'asusu polotini A (Thermo Fisher Scientific) fa'atasi ma le fa'ata'ita'iga i le 4°C ma lulu mālie mo le 1 itula, ona fa'aaoga lea o chelex beads (Bio-Rad) e fa'amauoa ai le DNA, ma fa'aaoga le proteinase K (Thermo Fisher) mo le fa'agae'eina o polotini. Na iloa le TNFα promoter e ala i le PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; i se isi itu, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (oloa 207-bp). O ata na gaosia e le Image Lab (Bio-Rad) ma fa'atatauina e ala i le fa'aaogaina o le polokalama ImageJ.
Sa aoina le suau'u o le sela e pei ona fa'amatalaina i luga. Sa fa'atinoina le fuafuaina e tusa ai ma faiga a le kamupani gaosi oloa o le human TNFα ELISA kit (Invitrogen), human IL-2 ELISA kit (Invitrogen) ma le human IFN-γ ELISA kit (Abcam). E tusa ai ma le fa'atulagaga a le kamupani gaosi oloa, sa fa'avaivaia le suau'u i le 1:100 e iloa ai le TNFα ma le IL-2, ma le 1:3 e iloa ai le IFN-γ. Fa'aaoga le EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) e fua ai le absorbance i le 450 nm.
Sa vavae’eseina le PBMC mai oloa vavae’eseina o leukocyte (STEMCELL Technologies) e ala i le Ficoll gradient density centrifugation. Sa vavae’eseina sela CD3 + mai le PBMC e fa’aaoga ai CD3 beads (Miltenyi). I le i ai pe leai foi o le MNA, sa fa’agaoioia sela CD3+ i le plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) ma le IL-2 (300 U/ml; Proleukin) mo le 3 aso. A mae’a aso e 3, sa aoina sela ma fufuluina i le 0.9% saline, ma sa fa’a’aisa loa le pellet. Sa faia le faitauga o sela e ala i le flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) e fa’aaoga ai le 123count eBeads.
Aveese metabolites e pei ona faʻamatalaina i luga. O le mea na faʻamamago na toe faʻafouina i le maualuga o le 4000 cell equivalents/μl. Iloilo le faʻataʻitaʻiga e ala i le reversed-phase chromatography (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ma le CORTECS T3 column (2.1 × 150 mm, particle size 1.6-μm, pore size 120-Å; #186008500, Waters). Polar mass spectrometer (6470, Agilent), lea e faʻagaoioia ai le electrospray ionization i le positive mode. O le mobile phase A o le 0.1% formic acid (i le H2O), o le mobile phase B o le 90% acetonitrile, 0.1% formic acid. O le LC gradient e 0 i le 2 minute mo le 100% A, 2 i le 7.1 minute mo le 99% B, ma le 7.1 i le 8 minute mo le 99% B. Ona toe fa'apaleni lea o le koluma ma le vaega feavea'i A i le fua fa'atatau o le tafe o le 0.6 ml/min mo le 3 minute. . O le fua fa'atatau o le tafe o le 0.4ml/min, ma fa'avevela le potu koluma i le 50°C. Fa'aaoga le tulaga fa'ata'ita'i vaila'au mama a le MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanata) e fa'amautu ai le taimi e taofia ai (RT) ma le suiga (RT = 0.882 minute, suiga 1 = 137→94.1, suiga 2 = 137→92, Suiga 3 = 137→78). A tupu uma suiga e tolu i le taimi sa'o e taofia ai, e fa'aaoga le suiga 1 mo le fuaina e fa'amautinoa ai le sa'o. O le pi'o masani o le MNA (Toronto Research Chemical Company) na gaosia e ala i le ono fa'asolosolo o le vai fa'aputu (1 mg/ml) e maua ai tulaga fa'atonuina o le 0.1, 1.0, 10 ma le 100 ng/ml ma le 1.0 ma le 10μg/ml vai. O le tapula'a iloa o le 1 ng/ml, ma o le tali laina e i le va o le 10 ng/ml ma le 10μg/ml. O tui ta'itasi o le lua microliters o fa'ata'ita'iga ma le tulaga fa'atonuina e fa'aaogaina mo le au'ili'iliga LC/MS, ma o se fa'ata'ita'iga fa'atonutonu lelei fefiloi e fa'atinoina i tui ta'i valu e fa'amautinoa ai le mautu o le fa'avae au'ili'iliga. O tali MNA o fa'ata'ita'iga sela uma na togafitia i le MNA sa i totonu o le laina laina o le su'ega. Na faia le au'ili'iliga o fa'amaumauga e fa'aaoga ai le polokalama au'ili'iliga fa'atatau a le MassHunter (v9.0, Agilent).
O le fausaga lona lua o le αFR-CAR na aumaia mai ia Song et al. (59). I se aotelega, o le fausaga o loʻo i ai mea nei: faasologa o le taitai CD8a, vaega fesuiaʻi o le filifili e tasi e faʻapitoa i le tagata αFR, vaega o le hinge ma le transmembrane o le CD8a, vaega o le sela o le CD27 ma le vaega o le sela o le CD3z. O le faasologa atoa o le CAR na faʻaputuina e le GenScript, ona faʻapipiʻiina lea i totonu o le vector faʻaalia o le lentiviral o le tupulaga lona lua i luga aʻe o le kaseti faʻaalia o le GFP na faʻaaogaina e iloilo ai le lelei o le transduction.
E gaosia le Lentivirus e ala i le transfection o sela HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); e ola i le Dulbecco's modified Eagle medium o lo'o i ai le 10% fetal bovine serum (FBS) ma le 1% PenStrep, ma fa'aaoga le CAR-GFP vector ma le packaging plasmids (psPAX2 ma le pMD2.G, Addgene) e fa'aaoga ai le lipofection amine (Sigma-Aldrich). O le supernatant o lo'o i ai le siama na aoina i le 48 ma le 72 itula talu ona mae'a le transfection, fa'amamāina, ma fa'aputuina e ala i le ultracentrifugation. Teu le viral supernatant fa'aputuina i le -80°C se'ia o'o i le transduction.
Ua vavae'eseina PBMC mai oloa vavae'ese leukocyte foa'i maloloina (STEMCELL Technologies) e ala i le Ficoll gradient density centrifugation. Faaaoga positive selection CD8 microbeads (Miltenyi) e vavae'ese ai sela CD8+ mai le PBMC. Fa'aosofia sela T i le TransAct (Miltenyi) ma i le TexMACS medium [Miltenyi; fa'aopoopo i le 3% heat-inactivated human serum, 1% PenStrep ma le IL-2 (300 U/ml)]. I le luasefulufa itula talu ona fa'aosofia, na fa'aliliuina sela T i le lentivirus (10 μl concentrated virus supernatant i le 106 sela). 1 i le 3 aso talu ona fa'aliliuina i luga o le Cytek Aurora (i luga o le FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), iloilo le fa'aalia o le GFP o sela e fa'aalia ai le lelei o le fa'aliliuina e le itiiti ifo i le 30%.
Sa fa'atupuina sela CAR-T mo le 24 itula i le Immunocult (STEMCELL Technologies; fa'aopoopo i ai le 1% PenStrep) i lalo o tulaga nei: a'o le'i togafitia, togafitia i le 250 μM adenosine po'o le 10 mM MNA. A mae'a le togafitiga muamua, sa fufuluina sela CAR-T i le PBS ma tu'ufa'atasia ma sela SK-OV-3 e 20,000 [ATCC; i le McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) fa'aopoopo i ai le 10% FBS ma le 1% PenStrep i le 10: O le effector to target ratio o le 1 sa fa'ateleina i le tolu taimi i le Immunocult medium fa'aopoopo. O sela SK-OV-3 ma sela SK-OV-3 na fa'afefiloi i le digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) sa fa'aaogaina o ni pulega leaga ma lelei. A maeʻa le 24 itula o le totoina faʻatasi, ona aoina lea o le supernatant ma fuaina le lactate dehydrogenase (LDH) e tusa ai ma faʻatonuga a le kamupani gaosi (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). O le LDH supernatant na faʻavaivaia i le 1:50 i le LDH buffer. O le pasene o le fasiotia na fuaina e faʻaaoga ai le fua faʻatatau lenei: pasene o le fasiotia = pasene o le faʻasaʻoga / fua faatatau maualuga o le fasiotia x 100%, lea o le pasene o le faʻasaʻoga = naʻo sela T-culture-co-cells, ma le fua faatatau maualuga o le fasiotia = pulea lelei-pulega leaga.
E pei ona faʻamatalaina i le tusitusiga poʻo meafaitino ma metotia, faʻaaoga le GraphPad Prism 8, Microsoft Excel poʻo le R v3.6.0 mo auʻiliʻiliga faʻamaumauga. Afai e tele faʻataʻitaʻiga e aoina mai le maʻi lava e tasi (e pei o le ascites ma le tumor), matou te faʻaaogaina se paired t test poʻo le aofia ai o le maʻi o se aafiaga faʻafuaseʻi i se linear poʻo se faʻataʻitaʻiga lautele e pei ona talafeagai ai. Mo le auʻiliʻiliga o le metabolomics, o le suʻega taua e faia faʻatolu.
Mo nisi fa'amatalaga fa'aopoopo mo lenei tusiga, fa'amolemole taga'i i le http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Apikaila Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi J. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
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©2021 American Association for the Advancement of Science. aia tatau uma ua taofia. AAAS ose paaga a HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ma COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.